Die Rolle der Serin-Threonin-Kinase-Cot in Proliferation, Differenzierung und Apoptose:
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2000
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1. INHALTSVERZEICHNIS
1. INHALTSVERZEICHNIS.
1
2. ZUSAMMENFASSUNG/SUMMARY. 5
3. EINLEITUNG.7
3.1 SIGNALTRANSDUKTION. 7
3.1.1 DIE KLASSISCHE ZYTOPLASMATISCHE KASKADE.10
3.1.1.1 DIE RAF-FAMILIE.12
3.1.2 STRESS-KINASEKASKADEN.13
3.1.3 BRUECKENPROTEINE.15
3.2 DIE SERIN/THREONIN KINASEN COT UND TPL-2.17
3
3
GEGENSTAND DER ARBEIT.19
4. MATERIAL.
21
4.1 GERAETE. 21
4.2 CHEMIKALIEN, ENZYME, ANTIKOERPER.22
4.2.1 CHEMIKALIEN.22
4.2.2 ENZYME.23
4.2.2.1 RESTRIKTIONSENZYME.23
4.2.2.2 SONSTIGE ENZYME.24
4.2.3 MOLEKULARGEWICHTSMARKER.24
4.2.3.1 MOLEKULARGEWICHTSMARICER FUER PROTEINE.24
4.2.3.2 MOLEKULARGEWICHTSMARKER FUER DNA.24
4.2.4 REAGENZIENSAETZE (KITS).24
4.2.5 ANTIKOERPER.25
43 BAKTERIENSTAEMME, HEFESTAEMME, BACULOVIREN UND PLASMIDE.26
4.3.1 BAKTERIENSTAEMME.26
4.3.2 HEFESTAEMME.26
4.3.3 BACULOVIREN.27
4.3.4 PLASMIDE.27
4.3.4.1 EUKARYOTISCHE KLONIERUNGS- UND EXPRESSIONSVEKTOREN.27
4.3.4.2 HEFE TWO-HYBRID PLASMIDE.28
4.3.4.3 SAEUGER EXPRESSIONS-KONSTRUKTE.29
4.3.4.4 HEFE TWO-HYBRID KONSTRUKTE.31
4.3.5 TWO-HYBRID CDNA-BIBLIOTHEKEN.31
4.4 MEDIEN ZUR AUFZUCHT VON BAKTERIEN UND HEFEN.32
4.4.1 BAKTERIENMEDIEN.32
4.4.2 HEFE-MEDIEN.32
4.5 VERSUCHSTIERE UND ZELLMATERIAL.33
4.5.1 VERSUCHSTIERE.33
4.5.2 ZELLMATERIAL.33
4.6 MEDIEN FUER DIE ZELLKULTUR.34
4.7 VERBRAUCHSMATERIALIEN.35
4.8 PUFFER UND LOESUNGEN.35
4.9 SONSTIGES.38
1
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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5. ARBEITSMETHODEN.39
5.1 MOLEKNLARBIOLOGISCHE METHODEN.39
5.1.1 BAKTERIENKULTUREN.39
5.1.2 HERSTELLUNG ULTRAKOMPETENTER BAKTERIEN.39
5.1.3 KONSTRUKTION VON EXPRESSIONSPLASMIDEN.40
5.1.3.1 RESTRIKTIONSVERDAU VON DNA.40
5.1.3.2 ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON DNA IN AGAROSE-GELEN.40
5.1.3.3 EXTRAKTION VON DNA AUS AGAROSE-GELEN.41
5.1.3.4 HERSTELLUNG VON BLUNT-END DNA-FRAGMENTEN.41
5.1.3.4.1 AUFFUELLEN VON 5'-ABERHANGENDEN DNA-ENDEN DURCH KLENOW-
BEHANDLUNG.41
5.1.3.4.2 VERDAU VON 3'-ABERHANGENDEN DNA-ENDEN DURCH T4-
POLYMERASE VERDAU.41
5.1.3.5 DEPHOSPHORYLIERUNG VON VEKTOR-DNA MIT CALF INTESTINAL
PHOSPHATASE.41
5.1.3.6 AUFREINIGUNG VON DNA-FRAGMENTEN.42
5.1.3.7 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN.42
5.1.3.8 TRANSFORMATION KOMPETENTER DH5A.42
5.1.4 PLASMIDISOLATION AUS ECOLI.:.43
5.1.4.1 ALKALISCHE LYSE ZUR PLASMID-DNA PRAEPARATION AUS ECOLI
(KLEINER MASSSTAB).43
5.1.4.2 ALKALISCHE LYSE ZUR PLASMID-DNA PRAEPARATION AUS . COLI
(GROSSER MASSSTAB).43
5.1.4.3 PLASMID-DNA-PRAEPARATION AUS ECOLI FUER ZELLKULTUR-
TRANSFEKTIONSEXPERIMENTE.44
5.1.4.4 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DNA.44
5.1.5 AMPLIFIKATION VON DNA-FRAGMENTEN MIT HILFE DER PCR.44
5.1.6 ERSTELLUNG VON PUNKTMUTATIONEN MIT HILFE DES QUICKCHANGE
YY
SITE DIRECTED MUTAGENESIS KIT.45
5.1.7 AUTOMATISCHE DNA-SEQUENZIERUNG MIT DEM ABI PRISM 377
INTEGRATED THERMAL CYCLER.45
5.2 ZELLKULTUR.45
5.2.1 BACULOVIRUS-EXPRESSIONSSYSTEM.45
5.2.1.1 AUFZUCHT VON SF-9-ZELLEN.46
5.2.1.2 INFEKTION VON SF9-ZELLEN MIT REKOMBINANTEN BACULOVIREN.46
5.2.2 293/NIH-ZELLKULTUR.46
5.2.2.1 TRANSFEKTION MIT EXPRESSIONSPLASMIDEN IN SAEUGERZELLEN.47
5.2.2.1.1 TRANSIENTE TRANSFEKTION NACH DER CALCIUMPHOSPHATMETHODE.47
5.2.2.1.2 TRANSFEKTION DURCH LIPOFECTAMINE (LIPOFEKTION).47
5.2.2.2 RETROVIREN ALS EFFIZIENTE VEKTOREN FUER DEN GENTRANSFER IN
SAEUGERZELLEN.48
5.2.2.2.1 VIRUSTITRATION.48
5.2.2.2.2 SOFT-AGAR-KLONIERUNG.49
5.2.3 PC12-ZELLEN.50
5.2.4 32D-ZELLEN/SURVIVAL-ASSAY.50
5.2.5 HERSTELLUNG PRIMAERER MILZTUMORZELLINIEN.50
53 MOLEKULARBIOLOGISCHES ARBEITEN MIT PROTEINEN.50
5.3.1 GEWINNUNG VON ZELL-LYSATEN.50
5.3.1.1 GEWINNUNG VON SF9-ZELL-LYSATEN.50
5.3.1.2 GEWINNUNG VON 293-ZELL-LYSATEN.51
5.3.1.3 GEWINNUNG VON ZELL-LYSATEN AUS MAUSORGANEN.51
5.3.2 WESTEM-BLOTS.51
2
53.2.1 VORBEREITUNG DER PROBEN.51
5.3.2.2 AUTRENNUNG VON PROTEINEN DURCH SDS-POLYACRYLAMID-
GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE).52
5.3.2.3 TRANSFER VON PROTEINEN AUF EINE NITROZELLULOSEMEMBRAN
(BLOTTEN).52
5.3.2.4 FAERBUNG DER MEMBRAN MIT PONCEAU S.53
53.2.5 IMMUNDETEKTION VON PROTEINEN.53
5.3.2.5.1 WESTEM-BLOTS STRIPPEN.53
5.3.3 PRAEZIPITATIONS- UND COIMMUNOPRAEZIPITATIONSEXPERIMENTE.53
5.3.4 KINASE-ASSAYS.54
5.3.5 REPORTERGEN ASSAYS.54
5.4 MOLEKULARBIOLOGISCHES ARBEITEN MIT RNA.55
5.4.1 RNA-EXTRAKTION.55
5.4.2 CDNA-SYNTHESE.55
5.4.3 RT-PCR.55
53 TWO-HYBRID SCREEN.56
5.5.1 AMPLIFIKATION VON CDNA-BIBLIOTHEKEN.57
5.5.2 HEFE-TRANSFORMATION UND TWO-HYBRID-TESTS.57
5.5.2.1 TRANSFORMATION VON S.CEREVISIAE MIT PLASMIDEN.58
5.5.2.2 DIREKTE TWO-HYBRID TESTS.58
5.5.2.3 TRANSFORMATION VON S.CEREVISIAE FUER TWO-HYBRID CDNA-
BIBLIOTHEK-SCREENS.58
5.5.2.3.1 BESTIMMUNG DER TRANSFEKTIONSEFFIZIENZ.59
5.5.2.4 X-GAL FILTERASSAY.59
5.5.2.5 BAIT-VERLUSTKULTUR.60
5.5.3 DNA-GEWINNUNG, SEQUENZIERUNG UND IDENTIFIKATION.60
5.5.3.1 PLASMIDISOLATION AUS HEFEZELLEN.60
5.5.3.2 TRANSFORMATION MIT PLASMID-ISOLATEN AUS HEFEZELLEN.61
5.5.3.3 IDENTIFIKATION VON CDNA-SEQUENZEN DURCH COMPUTERGESTUETZTEN
DATENBANKVERGLEICH.61
6. ERGEBNISSE.62
6.1 UNTERSUCHUNGEN ZTFR ROLLE VON COT IN DER KLASSISCHEN
ZYTOPLASMATISCHEN KINASEKASKADE.62
6.2 DIE ROLLE VON COT IN STRESSKINASEKASKADEN.64
63 EFFEKTE VON COT AUF TRANSFORMATION, DIFFERENZIERUNG UND
APOPTOSE.70
63
IN VIVO
UNTERSUCHUNGEN DER EFFEKTE VON ONKOGENEM COT.74
6.6 TWO-HYBRID.81
6.6.1 TEST DER TWO-HYBRID KONSTRUKTE AUF KORREKTE KLONIERUNG UND
FUNKTIONALITAET IMTWO-HYBRID ASSAY.81
6.6.2 SCREEN EINER 14,5 TAGE MAUSEMBRYO CDNA-BIBLIOTHEK.81
6.6.2.1 DIE KLEINE GTPASE RAN UND IHRE FUNKTION IM KEM-IM- UND EXPORT.82
6.6.2.2 UNTERSUCHUNGEN ZUR RAN-COT-INTERAKTION IN SAEUGERZELLEN UND
EFFEKTE AUF DIE COT-AKTIVITAET.84
6.6.2.3 DAS HITZESCHOCKPROTEIN HSP84.88
6.6.3 SCREEN EINER JURKAT T-ZELL-BIBLIOTHEK.88
6.6.3.1 MAUS-CASPASE 7 (MCH3).89
6.63.2 DER REL/NF-ICB SIGNALWEG.90
6.3.33 INTERAKTIONS- UND AKTIVIERUNGSSTUDIEN DER BINDUNG ZWISCHEN
NF-KBL-PL05 UND COT.93
3
7. DISKUSSION.97
7.1
DIE ROLLE VON COT IN VERSCHIEDENEN SIGNALTRANSDUKTIONSWEGEN
. 97
7.2.
TRANSFORMATIONSPOTENTIA! VON COT
IN VIVO
.101
7J IDENTIFIKATION NEUER COT INTERAKTIONSPARTNER MITTELS DES
TWO-HYBRID SYSTEMS.103
7.3.1 DIE ROLLE DER COT/NF-ICB-INTERAKTION IM NF-ICB-SIGNALWEG.103
7.3.1.1 COT UND NF-KB UND IHRE WIRKUNG AUF PROLIFERATION,
DIFFERENZIERUNG
UND APOPTOSE.107
7.3.2 RAN ALS INTERAKTIONSPARTNER VON COT.108
8. ABKUERZUNGEN.IN
9. LITERATUR.
1
13
ANHANG
.126
DANKSAGUNG. 126
LEBENSLAUF.-.127
VERZEICHNIS EIGENER PUBLIKATIONEN.128
ERKLAERUNG.129
4 |
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