Neuartige retrovirale Vektorsysteme für die Gentherapie: Entwicklung in Suspension wachsender Verpackungszellinien:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
München
Hieronymus
2000
|
| Ausgabe: | Als Typoskript gedr. |
| Schriftenreihe: | Biologie
|
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Zugl.: Stuttgart, Univ., Diss. |
| Beschreibung: | 114 S. Ill., graph. Darst. : 21 cm |
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4
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN
.
7
ZUSAMMENFASSUNG
.
9
EINLEITUNG
.
10
1
RETROVIREN
.
11
2
AUFBAU
UND
EIGENSCHAFTEN
RETROVIRALER
VEKTOREN
.
12
3
RETROVIRUS-VERPACKUNGSZELLINIEN
.
14
3.1
KONSTRUKTIONSSTRATEGIEN
.
15
3.2
MURINE
VERPACKUNGSZELLINIEN
.
17
3.3
HUMANE
VERPACKUNGSZELLINIEN
.
18
3.4
OPTIMIERUNGSSTRATEGIEN
.
19
4
ZIELSETZUNG
.
20
MATERIAL
UND
METHODEN
.
21
1
MATERIAL
.
21
1.1
CHEMIKALIEN
UND
BIOCHEMISCHE
REAGENZIEN
.
21
1.2
PUFFER
.
22
1.3
GERAETE
.
22
1.4
ZELLINIEN
.
22
1.4.1
ADHAERENTE
ZELLINIEN
.
22
1.4.2
SUSPENSIONSZELLINIEN
.
23
1.4.3
RETROVIRALE
VERPACKUNGSZELLINIEN
.
23
1.4.4
RETROVIRALE
PRODUZENTENZELLINIEN
UND
RETROVIRALE
VEKTOREN
.
23
1.4.5
ANTIKOERPER-PRODUZIERENDE
ZELLINIEN
.
24
1.5
ZELLKULTURMEDIEN
.
24
1.5.1
KULTURMEDIEN
FUER
ADHAERENTE
UND
IN
SUSPENSION
WACHSENDE
ZELLINIEN
.
24
1.5.2
SERUM-FREIE
KULTURMEDIEN
.
25
1.5.3
SELEKTIONSMEDIEN
.
25
1.6
BAKTERIENMEDIEN
.
25
1.7
BAKTERIENSTAMM.
.
25
1.8
PLASMIDE
.
26
1.9
OLIGONUKLEOTIDE
.
26
1.10
ANTIKOERPER
.
26
2
METHODEN
.
27
2.1
MOLEKULARGENETISCHE
ARBEITSMETHODEN
.
27
INHALTSVERZEICHNIS
5
2.1.1
POLYMERASE
KETTENREAKTION
.
27
2.1.2
SOUTHERN-BLOT
ANALYSE
.
27
2.2
ZELLBIOLOGISCHE
ARBEITSMETHODEN
.
28
2.2.1
ZELLKULTURFUHRUNG
.
28
2.2.2
ADAPTION
ADHAERENTER
ZELLINIEN
AN
SUSPENSIONS
WACHSTUM
.
28
2.2.3
PLASMIDTRANSFEKTION
.
29
2.2.4
ISOLIERUNG
CHROMOSOMALER
DNA
.
29
2.2.5
BESTIMMUNG
DER
GENERATIONSZEIT
.
30
2.2.6
ISOLIERUNG
STABIL
TRANSFIZIERTER
ZELLKLONE
.
30
2.3
ARBEITEN
MIT
REKOMBINANTEN
RETROVIREN
.
30
2.3.1
ERNTE
UND
LAGERUNG
VIRUSHALTIGER
UEBERSTAENDE
.
30
2.3.2
TRANSDUKTIONSMETHODEN
.
31
2.3.3
TITRATIONSMETHODEN
.
31
2.3.3.1
DIE
KONVENTIONELLE
G418-TITRATION
.
31
2.3.3.2
DIE
IMMUNFAERBUNGS-TITRATION
.
32
2.4
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
.
33
2.4.1
WESTEM-BLOT
ANALYSE
.
33
2.4.2
GEWINNUNG
DES
MONOKLONALEN
ANTI-ENV
ANTIKOERPERS
.
33
2.4.3
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
.
34
2.4.3.1
MESSUNG
VON
OBERFLAECHENPROTEINEN
.
34
2.4.3.2
MESSUNG
VON
GFP
.
34
2.4.3.3
EINZELZELLSORTIERUNG
.
34
ERGEBNISSE
.
35
A
ENTWICKLUNG
RETROVIRALER
SUSPENSIONSVERPACKUNGSZELLINIEN
.
35
1
KONSTRUKTION
DER
HELFERPLASMIDE
.
35
1.1
GAG-POL-HELFERPLASMIDE
.
35
1.2
ENV-HELFERPLASMIDE
.
36
1.3
ANALYSE
DER
SEQUENZHOMOLOGIEN
.
37
2
EVALUIERUNG
VON
SUSPENSIONSZELLINIEN
.
38
2.1
WACHSTUMSVERHALTEN
.
38
2.2
NACHWEIS
ENDOGENER
MOMLV-SEQUENZEN
.
39
2.3
TRANSIENTE
VIRUSPRODUKTION
.
40
2.4
TRANSFEKTIONSOPTIMIERUNGEN
.
41
3
HERSTELLUNG
RETROVIRALER
SUSPENSIONSPRODUZENTENKULTUREN
AUS
ADHAERENTEN
ZELLINIEN
.
44
3.1
DIE
RETROVIRALE
VERPACKUNGSZELLINIEN
FLYA13
.
44
3.1.1
HERSTELLUNG
VON
FLYA13LANSN-PRODUZENTENZELLKLONEN
.
44
INHALTSVERZEICHNIS
6
3.1.2
ADAPATION AN
SUSPENSIONSWACHSTUM
.
46
3.1.3
BESTIMMUNG
UND
VERGLEICH
DER
VIRUSTITER
.
48
3.1.4
WACHSTUMSVERHALTEN
IN
SUSPENSION
.
52
3.2
HEK293
SUSPENSIONSVERPACKUNGSZELLINIEN
.
54
3.2.1
HERSTELLUNG
VON
GAG-POL-PRODUZENTENKLONEN
.
56
3.2.2
HERSTELLUNG
VON
VERPACKUNGSZELLKLONEN
.
58
3.2.2.1
EVALUIERUNG
DER
VERPACKUNGSZELLKLONE
.
59
3.2.2.2
ANALYSE
DER
GFP
UND
ENV-EXPRIMIERENDEN
ZELLPOPULATIONEN
.
62
3.2.2.3
EINZELZELLABLAGE
UND
EVALUIERUNG
DER
VERPACKUNGSZELLINIEN
.
62
3.2.3
HERSTELLUNG
STABILER
HEK293-PRODUZENTENZELLKLONE
.
66
3.2.4
HERSTELLUNG
VON
SUSPENSIONSPRODUZENTENZELLINIEN
.
71
3.2.4.1
ADAPATION
AN
SUSPENSIONSWACHSTUM
.
71
3.2.4.2
WACHSTUMSVERHALTEN
.
72
3.2.4.3
VIRUSTITER
DER
SUSPENSIONSPRODUZENTENZELLINIE
E17A30-12.
1
IS
.
74
3.2.4.4
E17A30-12.11S-TRANSDUKTIONSRATEN
.
76
B
STUDIEN
ZUR
SUPERINFIZIERBARKEIT
UND
STABILITAET
RETROVIRALER
VERPACKUNGSZELLINIEN
.
79
1
SUPERINFEKTIONSEXPERIMENTE
MIT
VERPACKUNGS
UND
PRODUZENTENZELLINIEN
.
79
1.1
TRANSDUKTIONSRATEN
.
80
1.2
MEHRFACH-TRANSDUKTIONEN
.
81
1.3
VERGLEICH
VON
AMPHOTROPEN
VERPACKUNGS
UND
PRODUZENTENZELLINIEN
.
82
2
ISOLIERUNG
VON
KURZZEIT
UND
LANGZEIT-RETROVIRUSPRODUZENTENZELLKLONEN
.
83
2.1
BESTIMMUNG
DER
ANZAHL
AN
REKOMBINATEN
PROVIRUSINTEGRATEN
.
84
2.2
EVALUIERUNG
DER
VIRUSVEKTORPRODUKTION
.
90
2.2.1
TRANSDUKTIONSEFFIZIENZEN
.
90
2.2.2
TITERBESTIMMUNGEN
.
93
DISKUSSION
.
95
1
ENTWICKLUNG
VON
SUSPENSIONSVERPACKUNGSZELLINIEN
.
95
1.1
EINFLUESSE
AUF
DEN
BEDARF
AN
RETROVIRALEN
VEKTOREN
.
95
1.2
EVALUIERUNG
IN
SUSPENSIONSKULTUR
WACHSENDER
RETROVIRALER
VERPACKUNGSZELLINIEN
.
97
1.3
SCHLUSSFOLGERUNG
UND
AUSBLICK
.
103
2
STABILITAET
DER
PRODUZENTENZELLINIE
HSRBMLT1
.
103
2.1
SCHLUSSFOLGERUNGEN
.
104
LITERATURVERZEICHNIS
.
106 |
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