Die Ena-VASP-Familie Zytoskelett-assoziierter Proteine: Aufklärung von Funktionen der EVH2 (Ena-VASP-homology-2)-Domäne
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German English |
| Veröffentlicht: |
1999
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| Beschreibung: | Würzburg, Univ., Diss., 1999. - Zsfassung in dt. und engl. Sprache |
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
A. ZUSAMMENFASSUNG - SUMMARY_ 1
1. ZUSAMMENFASSUNG - DEUTSCH_1
2. SUMMARY - ENGLLSH_2
B. EINLEITUNG _ 3
1. OBERBLICK: DAS VASODILATATOR-STIMULIERTE PHOSPBOPROTEIN (VASP)_3
2. DIE MITGLIEDER DER ENA/VASP-PROTEINFAMILIE_4
2.1. DROSOPHILA ENABLED (ENA)_4
2.2. MAMMALIAN ENABLED (MENA)_ 5
2.3. ENA/VASP-//E (EVL) UND RNB6_ 6
2.4. AVIAN ENABLED (AVENA)_ 6
3. BEDEUTUNG DER PHOSPHORYLIERUNG_6
4. GEWEBSSPEZIFISCHE VERTEILUNG UND INTRAZELLULARE LOKALISATION VON
VASP_7
5. STRUKTUR UND EIGENSCHAFTEN DER VASP-DOMAENEN J_ 8
5.1. EVH1-DOMAENE_ 8
5.2. PROLIN-REICHE DOMAENE 9
5.3. EVH2-DOMAENE_ 10
6. HINWEISE AUF EINE FUNKTION VON VASP UND ANDEREN MITGLIEDERN DER
ENA/VASP-FAMILIE
BEI DER REGULATION DER AKTINPOLYMERISATION_ 10
7. AUFGABENSTELLUNG_ 13
C. MATERIAL UND METHODEN_ 14
1. MATERIAL_ 14
1.1. BAKTERIEN (E.COLI)_ 14
1.1.1. BAKTERIEN-STAEMME 14
1.1.2. MEDIEN UND AGARPLATTEN FUER BAKTERIEN_ 14
1.1.3. ZUSAETZE FUER MEDIEN UND AGARPLATTEN_ 15
1.2. KULTURZELLEN FUER TRANSFEKTIONS-EXPERIMENTE_ 15
1.2.1. PUFFER, LOESUNGEN, MEDIEN UND SEREN FUER DIE ZELLKULTUR_ 15
1.3. VEKTOREN UND PLASMIDE_ 16
1.3.1. VEKTOREN_ 16
1.3.2. PLASMIDE_ 16
1.4. OLIGONUKLEOTID-PRWJER_ 17
1.4.1. OLIGONUKLEOTID-PRIMER FUER DIE HERSTELLUNG DER VASP-MUTANTEN_ 17
1.4.2. SONSTIGE VASP-SPEZIFISCHE PRIMER FUER PCR UND SEQUENZIERUNG_ 18
1.4.3. VEKTORSTAENDIGE
PRIMER FUER DIE SEQUENZIERUNG_19
1.5. CHEMIKALIEN_ 19
1.6. ENZYME_ 19
1.7. AGAROSE UND ACRYLAMID FUER DIE GEL-ELEKTROPHORESE_20
1.8. GROESSENSTANDARDS_ 20
1.9. KITS_ 20
1.10. TRANSFEKTIONSREAGENZ_ 20
1.11. ANTISEREN, MONOKLONALE ANTIKOERPER UND FLUORESZENZ-MARKIERTE
PHALLOIDINE_21
I
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/959856544
INHALTSVERZEICHNIS
1.11.1. PRIMAERANTIKOERPER_21
1.11.2. SEKUNDAERANTIKOERPER, PROTEIN A UND FLUORESZENZ-MARKIERTE
PHALLOIDINE_22
1.12. SONSTIGE PROTEINE_23
1.13. LOESUNGEN: PBS FUER PROTEINE_23
1.14. KREUZVEMETZER (CROSS-LINKER)_23
1.15. VERBRAUCHSMATERIALIEN_23
1.16. GERAETE _ 24
2. METHODEN ZUR ISOLIERUNG UND MODIFIZIERUNG VON DNA_25
2.1. TRANSFORMATION VON E.COLI_25
2.1.1. PRAEPARATION KOMPETENTER CO//-ZELLEN NACH DER
CALCIUMCHLORID-METHODE_25
2.1.2. TRANSFORMATION KOMPETENTER .CO//-ZELLEN_26
2.2. AUFBEWAHRUNG VON . CO//-STAEMMEN ALS GLYCERINKULTUREN _26
2.3. HORIZONTALE AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE ZUR AUFTRENNUNG VON
DNA-FRAGMENTEN _26
2.4. ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA_27
2.4.1. SCHNELLPRAEPARATION VON PLASMID-DNA ZUM RESTRIKTIONSVERDAU (NACH
BIMBOIM
& DOLY, 1979; VEREINFACHT UND VERKUERZT)_27
2.4.2. PRAEPARATION GROESSERER MENGEN PLASMID-DNA FUER TRANSFEKTION UND
SEQUENZIERUNG
{PLASMID MIDI ODER MAXI KIT,
QIAGEN)
_27
2.5. AMPLIFIZIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN DURCH DIE
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION (PCR)
(SAIKI ET AL, 1988)_28
2.5.1. SPLICE OVERLAP EXTENSION (SO)-METHODE (HORTON ET AL., 1989) ZUR
EINFUEHRUNG
VON PUNKTMUTATIONEN MITTELS PCR_28
2.6. VERDAU VON PLASMID-DNA ODER PCR-FRAGMENTEN MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN_29
2.7. AUSFAELLEN VON DNA _30
2.8. AUFREINIGUNG VON PCR-PRODUKTEN MIT DEM QIAQUICK PCR PURIFICATION
KIT
(QIAGEN)_
30
2.9. AUFREINIGUNG VON DNA-FRAGMENTEN NACH RESTRIKTIONSVERDAU_30
2.9.1. AUFREINIGUNG MIT DEM
QIAQUICK PCR PURIFICATION KIT
(QIAGEN)
_30
2.9.2. AUFREINIGUNG MIT DEM QIAQUICK GEL EXTRACTION KIT
(QIAGEN)
_30
2.10. ENTFERNUNG UEBERHAENGENDER 3'-ENDEN MIT DER T4 DNA-POLYMERASE_31
2.11. LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN _31
2.12. PLASMIDSEQUENZIERUNGEN NACH DER DIDEOXY-METHODE (SAENGER ET AL.,
1977)_31
3. PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN_32
3.1. GEL-ELEKTROPHORESE VON PROTEINEN_32
3.1.1. DENATURIERENDE GEL-ELEKTROPHORESE_32
3.1.1.1. DENATURIERENDE GEL-ELEKTROPHORESE NACH LAEMMLI (1970)_32
3.1.1.2. TRICIN-GEL-ELEKTROPHORESE NACH SCHAEGGER & VON JAGOW (1987)_33
3.1.1.3. NICHT-REDUZIERENDE, DENATURIERENDE GEL-ELEKTROPHORESE
(NICHT-REDUZIERENDE SDS-PAGE)_34
3.1.2. NATIVE (NICHT-DENATURIERENDE) GEL-ELEKTROPHORESE FUER DIE
AUFTRENNUNG VON G-
AKTIN-PROTEINKOMPLEXEN (SAFER, 1989; MODIFIZIERT)_34
3.1.2.1. NATIVE POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE_35
3.1.2.2. NATIVE AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE_35
3.2. COOMASSIE BLAU-FAERBUNG VON PROTEINGELEN_36
3.3. TROCKNEN VON GELEN_36
3.4. IMMUNOMARKIERUNG SPEZIFISCHER PROTEINE {WESTERN BLOT) (TOWBIN ET
AL., 1979)_36
3.4.1. TRANSFER_36
3.4.2. ANFAERBEN VON PROTEINEN AUF 5/OT-MEMBRANEN_37
3.4.3. ENTWICKLUNG DES BLOTS MIT ANTIKOERPERN_37
II
INHALTSVERZEICHNIS
3.5. UEBEREXPRESSION UND AFFINITAETSREINIGUNG VON REKOMBINANTEN
YYHIS-TAG"-PROTEINEN MIT
DEM YYQIAEXPRESS-SYSTEM" (QIAGEN)_38
3.5.1. KONSTRUKTION DER REKOMBINANTEN EXPRESSIONSPLASMIDE_38
3.5.2. UEBERPRUEFUNG DER EXPRESSION IM KLEINEN MASSSTAB_38
3.5.3. OPTIMIERUNG DER PROTEINUEBEREXPRESSION_39
3.5.4. UEBEREXPRESSION DER FUSIONSPROTEINE IM GROSSANSATZ_39
3.5.5. REINIGUNG_39
3.5.5.1. REINIGUNG DER HOCHEXPRIMIERTEN VASP-FRAGMENTE HIS-PP, HIS-EVH2,
HIS-B/C, HIS-/C UND HIS-B/_ 40
3.5.5.2. REINIGUNG DER SCHWACH EXPRIMIERTEN VASP-FRAGMENTE (HIS-VASP,
HIS-VASPAC, HIS 1-276, HIS 1-258, HIS 1-224)_41
3.6. AKTIN-REINIGUNG AUS SCHWEINE-SKELETTMUSKEL_42
3.7. UMPUFFEM VON GEREINIGTEN PROTEINEN_42
3.7.1. DIALYSE_42
3.7.2. GELFILTRATION UEBER PD-10 SAEULEN_43
3.8. BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION_43
3.8.1. PROTEINBESTIMMUNG NACH LOWRY ET AL. (1951)_43
3.8.2. PROTEINBESTIMMG. DURCH ABSORPTIONSMESSUNG IM UV-BEREICH
(STOSCHEK, 1990) 44
3.8.3. AMIDOSCHWARZ-TUEPFELTEST_'_44
3.9. TCA-FAELLUNG_45
3.10. GELFILTRATION_45
3.11. SACCHAROSEGRADIENTEN-ZENTRIFUGATION (NACH MARTIN & AMES, 1961)_45
3.12. BERECHNUNG DER MOLEKULARMASSEN DER VASP-MUTANTEN MITTELS DER
GEMESSENEN
STOKES-RADIEN UND DER SEDIMENTATIONSKOEFFIZIENTEN_46
3.13. CHEMISCHE KREUZVEMETZUNG VON VASP-MUTANTEN (CHEMICAL
CROSS-LINKING)_46
3.14. KREUZVEMETZUNG VON G-AKTIN UND HIS-VASP-MUTANTEN _47
3.15. KREUZVEMETZUNG VON MBS-G-AKTIN MIT VASP UND VASP-MUTANTEN_47
3.15.1. HERSTELLUNG VON MBS-G-AKTIN (BETTACHE
ET AL. 1989, 1990)_47
3.15.2. KREUZVEMETZUNG VON MBS-G-AKTIN MIT HIS-VASP_48
3.16. FESTPHASENBINDUNGS-^.WAY_48
3.17. PHOSPHORYLIERUNG VON HIS-VASP_49
3.18. CO-SEDIMENTATION VON VASP-MUTANTEN MIT F-AKTIN_49
3.19. LICHTMIKROSKOPISCHE ANALYSE DER EFFEKTE VERSCHIEDENER
VASP-MUTANTEN AUF F-AKTIN-
SUPRASTRUKTUREN (KOMEEVA & JOCKUSCH, 1996; MODIFIZIERT)_50
3.20. INDIREKTE IMMUNFLUORESZENZ-MIKROSKOPIE_50
4. ZELLKULTUR_51
4.1. KULTURBEDINGUNGEN_51
4.2. PASSAGIEREN ADHAERENTER ZELLEN_51
4.3. EINFRIEREN UND AUFTAUEN VON KULTURZELLEN_51
4.4. TRANSFEKTION ADHAERENTER ZELLEN_52
4.4.1. CALCIUMPHOSPHAT-METHODE_52
4.4.2. TRANSFEKTION MIT FUGENE 6-TRANSFEKTIONS REAGENZ_53
5. COMPUTERPROGRAMME_53
D. ERGEBNISSE _
54
1. KONSTRUKTION DER IN DIESER ARBEIT VERWENDETEN VASP-PIASMIDE_54
1.1. KONSTRUKTION VON VASP-MUTANTEN FUER DIE TRANSIENTE EXPRESSION IN
ZELL-LINIEN_54
III
INHALTSVERZEICHNIS
1.1.1. PLASMID PVSV-VASP:
EXPRESSION VON N-TERMINAL YYVSV-GETAGGTEM" VASP_55
1.1.2. PLASMIDE PW107 UNDPW195:
EXPRESSION N-TERMINALER VASP-FRAGMENTE (YYVS V-GETAGG?')_55
1.1.3. PLASMIDE PW107-C, PVV107-/C, PVV195-C, PVV195-/C:
EXPRESSION VON VASP-MUTANTEN MIT INTERNEN DELETIONEN (YYVSV-GETAGG/")_56
1.1.4. PLASMIDE PCD-PP, PCD-EVH2, PCD-B/C, PCD-/C UND PCD-B/:
EXPRESSION VON C-TERMINALEN VASP-FRAGMENTE (OHNE TAG)_57
1.1.5. PLASMIDE PVSV-AST, PVSV-SAT, PVSV-SSA, PVSV-AAT, PVSV-AAA :
EXPRESSION VON KONSTITUTIV DEPHOSPHORYLIERTEN VASP-MUTANTEN
(YYV SV-GETAGGT") 58
1.1.5.1. HERSTELLUNG DER EINZELMUTANTEN PVSV-AST, PVSV-SAT, PVSV-SSA _
58
1.1.5.2. HERETEILUNG DER DOPPEL- UND DREIFACHMUTANTEN PVSV-AAT UND
PVSV-AAA 59
1.2. KONSTRUKTION V. PLASMIDEN F. DIE EXPRESSION VON VASP UND
VASP-MUTANTEN IN E.COLI 61
1.2.1. PLASMIDE PQE30-PP, PQE30-EVH2, PQE30-B/C, PQE30-/C, PQE30-B/:
EXPRESSION VON C-TERMINALEN VASP-FRAGMENTEN (YYHIS-GETAGGT")_61
1.2.2. PLASMID PQE30-VASP:
EXPRESSION VON HEXAHISTIDIN-YYGE/AGG/EM" WILDTYP-VASP (HIS-VASP)_61
1.2.3. PLASMIDE PQE30-VASPAC, PQE30-VASP 1-276, PQE30-VASPL-258 UND
PQE30-VASP1-224: EXPRESSION N-TERMINALER VASP-FRAGMENTE
(YYHIS-GE/AGG/")62
2. SUBZELLULAERE LOKALISATION VON
DROSOPHILA ENABLED (ENA) UND ENA-MUTANTEN_68
2.1. ENA-LOKALISATION AN FOKALEN KONTAKTEN UND STRESSFASEM_68
2.2. CO-LOKALISATION VON ENA MIT SEINEM DIREKTEN BINDUNGSPARTNER
PROFILIN_70
2.3. CO-LOKALISATION VON ENA MIT SEINEM BINDUNGSPARTNER ZYXIN UND
FEHL-LOKALISATION
BINDUNGS-DEFIZIENTER ENA-MUTANTEN_71
3. UNTERSUCHUNGEN ZU EINER MOEGLICHEN BINDUNG VON G-AKTIN AN VASP_74
3.1. NATIVE AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE_ 74
3.2. CHEMISCHE KREUZVEMETZUNG VON VASP MIT G-AKTIN_74
3.3. CHEMISCHE KREUZVEMETZUNG VON VASP MIT MBS-G-AKTIN_75
3.4. FESTPHASENBINDUNGS-I4SSAY _75
4. INTRAZELLULAERE LOKALISATION VON N-TERMINALEN VASP-FRAGMENTEN_76
4.1. SUBZELLULAERE LOKALISATION VON N-TERMINAL "VSV-GETAGGTEM"
WILDTYP-VASP_76
4.2. SUBZELLULAERE LOKALISATION VON N-TERMINALEN VASP-FRAGMENTEN UND VON
VASP-MUTAN
TEN MIT INTERNEN DELETIONEN_76
5. FUNKTION DER EVH2-DOMAENE _78
5.1. SEQUENZVERGLEICH DER EVH2-DOMAENEN VON
ENA/VASP-FAMILIENMITGLIEDEM_78
5.2. EXPRESSION VON VASP-FRAGMENTEN UND WILDTYP-VASP ALS
HEXAHISTIDIN-YYGE/AGG/E"
PROTEINE IN E.COLI UND REINIGUNG DER VASP-PROTEINE_78
5.3. VASP-TETRAMERISIERUNG _ 81
5.3.1. CHEMISCHE KREUZVEMETZUNG (
CROSS-LINKING) VON HIS-B/C, HIS-/C UND HIS-B/ 82
5.3.2. GELFILTRATION UND SACCHAROSEGRADIENTEN-ZENTRIFUGATION_83
5.4. CHARAKTERISIERUNG DER VASP/F-AKTIN-BINDUNG_ 87
5.4.1. IN VI'/RO-F-AKTIN-BINDUNG UND -BUENDELUNG DURCH DIE EVH2-DOMAENE_87
5.4.2. SUBZELLULAERE LOKALISATION VON C-TERMINALEN VASP-FRAGMENTEN_89
E. DISKUSSION_ _92
1. CO-LOKALISATION VON ENA MIT STRUKTUREN DES ZYTOSKELETTS UND
FEHL-LOKALISATION
FUNKTIONELLER ENA-MUTANTEN_ 92
IV
INHALTSVERZEICHNIS
2. BINDET VASP G-AKTIN ?_ 93
3. SUBZELLULLRE LOKALISATION VON VASP-FRAGMENTEN MIT C-TERMINALEN UND
INTERNEN
DELETIONEN_ 94
4. TETRAMERISIERUNG UND F-AKTIN-BINDUNG UND -BUENDELUNG DURCH DIE
VASP-EVH2-
DOMAENE_ 94
4.1. STRUKTUR DER EVH2-DOMAENE: 3 KONSERVIERTE BLOECKE_94
4.2. BLOCK C IST FUER DIE TETRAMERISIERUNG ESSENTIELL_95
4.3. BLOCK B IST ESSENTIELL FUER DIE F-AKTIN-BINDUNG_96
4.4. VASP-TETRAMERISIERUNG VERSTAERKT DIE VASP-PROTEININTERAKTIONEN
ENTFERNTERER
BINDUNGSSTELLEN_98
4.5. DIE VASP-LOKALISATION AN STRESSFASEM UND FOKALEN KONTAKTEN WIRD
DURCH
UNTERSCHIEDLICHE SEQUENZEN VERMITTELT_ 100
F. LITERATUR_ 102
G. ABKUERZUNGEN_ HO
V |
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