Einfluß der Cystein-Reste der Dipeptidylpeptidase IV/CD26 auf Struktur-Funktions-Beziehungen des multifunktionellen Proteins:
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1999
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
I-V
1.
EINLEITUNG
1
1.1
SYNTHESE
UND
STRUKTUR
VON
MEMBRANPROTEINEN
1
1.1.1
TRANSLATION
VON
INTEGRALEN
MEMBRANPROTEINEN
1
1.1.2
POSTTRANSLATIONALE
MODIFIKATIONEN
UND
SORTIERUNG
VON
INTEGRALEN
2
MEMBRANPROTEINEN
1.1.2.1
BILDUNG
DER
CYSTINBRUECKEN
3
1.1.2.2
FALTUNG
UND
QUALITATIVE
KONTROLLE
VON
NEUSYNTHETISIERTEN
PROTEINEN
3
IM
ER
1.1.2.3
GLYKOSYLIERUNGEN
UND
WEITERE
POSTTRANSLATIONALE
MODIFIKATIONEN
4
1.2
DIPEPTIDYLPEPTIDASE
IV
(DPPIV/CD26)
5
1.2.1
VORKOMMEN
DER
DPPIV/CD26
5
1.2.2
DIE
STRUKTUR
DER
RATTEN-DPPIV/CD26
6
1.2.3
BIOSYNTHESE
UND
PROZESSIERUNG
DER
DPPIV/CD26
9
1.2.4
ZELLULAERE
EXPRESSION
UND
LOKALISATION
DER
DPPIV/CD26
9
1.2.5
BIOLOGISCHE
FUNKTIONEN
DER
DPPIV/CD26
10
1.2.5.1
ENZYMATISCHE
AKTIVITAET
DER
DPPIV/CD26
10
1.2.5.2
DPPIV/CD26
ALS
ZELLADHAESIONSPROTEIN
11
1.2.5.3
DPPIV/CD26
UND
DAS
IMMUNSYSTEM
12
1.2.5.4
DIE
ROLLE
DER
DPPIV/CD26
BEI
DER
HIV-LNFEKTION
14
2.
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
15
3.
MATERIAL
UND
METHODEN
16
3.1
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
16
3.1.1
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
(MINI-LYSAT-METHODE)
16
3.1.2
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
(MIDI-LYSAT-METHODE,
QIAGEN)
17
3.1.3
FAELLUNG
VON
DNA
18
3.1.4
PHOTOSPEKTROMETRISCHE
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
DNA/RNA
18
INHALTSVERZEICHNIS
II
3.1.5
ERZEUGUNG
VON
PUNKTMUTANTEN
DURCH
ORTSSPEZIFISCHE
MUTAGENESE
18
3.1.5.1
SCULPTOR-SYSTEM
(AMERSHAM)
18
3.1.5.2
QUIKCHANGE-SITE-DIRECTED-MUTAGENESIS-SYSTEM
(STRATAGENE)
24
3.1.6
DNA-SEQUENZIERUNG
(T7-SEQUENZING-KIT,
PHARMACIA/
BIOTECH)
28
3.1.7
ANALYTISCHER
DNA-VERDAU
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
30
3.1.8
ANALYTISCHE
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
31
3.1.9
ANALYTISCHE
ACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
32
3.1.10
PRAEPARATIVER
DNA-VERDAU
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
32
3.1.11
PRAEPARATIVES
AGAROSEGEL
33
3.1.12
DNA-GELEXTRAKTION
(QIAEX-KIT,
QIAGEN)
33
3.1.13
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
IN
VEKTOREN
34
3.1.14
TRANSFORMATION
VON
LIGATIONSANSAETZEN
IN
KOMPETENTE
E
COLI
-ZELLEN
34
HB101
3.2
ZELLKULTURMETHODEN
37
3.2.1
KULTIVIERUNG
VON
CHO-ZELLEN
(CHINESE-HAMSTER-OVARY)
37
3.2.2
TRANSFEKTION
MITTELS
ELEKTROPORATION
37
3.2.3
STABILE
TRANSFEKTION
MITTELS
SUPERFECT-REAGENZ
(QIAGEN)
39
3.2.4
FAERBUNG
VON
CHO-ZELLEN
ZUR
SORTIERUNG
UND
ZUR
FACS-ANALYSE
39
3.2.5
SELEKTION
VON
STABIL
TRANSFIZIERTEN
ZELLEN
DURCH
KLONIERUNG
40
3.3
PROTEINCHEMISCHE
UND
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
40
3.3.1
BESTIMMUNG
DER
ENZYMLOKALISATION
DURCH
IMMUNFLUORESZENZ
40
(PERMEABILISIERTE/NICHT
PERMEABILISIERTE
ZELLEN)
3.3.2
PRAEPARATION
VON
ZELLEN
FUER
DIE
KONFOKALE
LASERMIKROSKOPIE
41
3.3.3
SOLUBILISIERUNG
VON
CHO-ZELLEN
42
3.3.4
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
(BCA-METHODE,
PIERCE)
43
3.3.5
BESTIMMUNG
DER
DPPIV/CD26-ENZYMAKTIVITAET
IN
LOESUNG
43
3.3.6
PROTEIN-CROSSLINKING
43
3.3.7
IMMUNPRAEZIPITATION
VON
DPPIV/CD26
MIT
ANTISERUM
AS
3
K
7
44
3.3.8
DISKONTINUIERLICHE
NATRIUMDODECYLSULFAT-POLYACRYLAMID-GELELEKTRO
45
PHORESE
(SDS-PAGE)
3.3.9
WESTEM-PROTEIN-BLOTTING
46
3.3.10
PONCEAU-ROT-FAERBUNG
46
3.3.11
IMMUNOLOGISCHE
DETEKTION
AUF
BLOTMEMBRANEN
DURCH
LUMINOL
46
III
INHALTSVERZEICHNIS
3.3.12
NACHWEIS
VON
DPPIV/CD26-AKTIVITAET
AUF
BLOTMEMBRANEN
47
3.3.13
AUFREINIGUNG
VON
DPPIV/CD26
AUS
RATTENLEBER
48
3.3.14
TITRATION
VON
FREIEN
SH-GRUPPEN
DER
DPPIV/CD26
50
3.3.15
PULSE-CHASE
EXPERIMENT
51
4.
ERGEBNISSE
52
4.1
MOLECULAR-MODELLING-ANALYSE
DER
RATTEN
DPPIV/CD26
52
4.2
BESTIMMUNG
FREIER
CYSTEIN-RESTE
BEI
WILDTYP
RATTEN-DPPIV/CD26
53
4.2.1
AUFREINIGUNG
VON
DPPIV/CD26
AUS
RATTENLEBER
53
4.2.2
TITRATION
FREIER
CYSTEINGRUPPEN
MIT
5,5'-DITHIO-BIS(2-NITROBENZOE
SAEURE)
55
4.3
ERZEUGUNG
VON
CYSTEIN-PUNKTMUTATIONEN
DURCH
ORTSSPEZIFISCHE
MUTAGENESE
56
4.4
KLONIERUNG
DER
MUTIERTEN
DPPIV/CD26-CDNA
IN
DEN
EUKARYOTISCHEN
EXPRESSIONSVEKTOR
PRC/CMV
58
4.4.1
HERSTELLUNG
DER
CYSTEINMUTANTE
C326G
58
4.4.2
HERSTELLUNG
DER
CYSTEIN-MUTANTEN
C299G,
C383G,
C455G
UND
C650G
60
4.4.3
HERSTELLUNG
DER
CYSTEIN-MUTANTEN
C337S,
C395S,
C445S,
C448S,
C473S,
C552S
UND
C763S
62
4.5
TRANSFEKTION
DER
MUTIERTEN
DPPIV/CD26-CDNA
IN
CHO-ZELLEN
UND
SORTIERUNG
DER
STABILEN
TRANSFEKTANDEN
63
4.6
UNTERSUCHUNG
DER
ZELLULAEREN
LOKALISATION
DER
CYSTEIN-MUTANTEN
64
4.6.1
I
MMUNFLUORESZENZMIKROSKOPISCHE
ANALYSE
64
4.6.2
FACS-ANALYSE
70
4.6.3
ANALYSE
MIT
KONFOKALER
LASERMIKROSKOPIE
74
4.7
UNTERSUCHUNG
DER
PROTEINEXPRESSION
DER
CYSTEIN-MUTANTEN
STABILEN
DPPIV/CD26-TRANSFEKTANDEN
DURCH
WESTERN-BLOT
75
4.8
KINETISCHE
UNTERSUCHUNGEN
DER
PROTEIN-STABILITAET
UND
PROZESSIERUNG
DURCH
PULSE-CHASE
EXPERIMENTE
77
4.8.1
CYSTEINMUTATIONEN
VERMINDERN
DIE
HALBLEBENSZEIT
DER
DPPIV/CD26
ZUM
TEIL
DRAMATISCH
77
INHALTSVERZEICHNIS
IV
4.8.2
DIE
OLIGOSACCHARID-SEITENKETTEN
DER
CYSTEIN-MUTANTEN
ZEIGEN
DREI
80
VERSCHIEDENE
PROZESSIERUNGSMUSTER
4.9
CYSTEIN-MUTATIONEN
HABEN
EINEN
UNTERSCHIEDLICHEN
EINFLUSS
AUF
DIE
82
DIMERISIERUNG
DER
DPPIV/CD26
4.10
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
ENZYMAKTIVITAET
DER
CYSTEIN-MUTANTEN
84
4.10.1
CYSTEIN-MUTANTEN
DER
DPPIV/CD26
ZEIGEN
UNTERSCHIEDLICHE
84
ENZYMAKTIVITAET
4.10.2
DIE
DPPIV/CD26-ENZYMAKTIVITAET
IST
AN
DAS
AUFTRETEN
EINER
150
KD
85
FORM
GEBUNDEN
5.
DISKUSSION
8
7
5.1
DATENBANKVERGLEICH
DER
DPPIV/CD26-SEQUENZ
MIT
HOMOLOGEN
87
PROTEINEN
UND
SUCHE
NACH
VERWANDTEN
STRUKTURMOTIVEN
5.2
BESTIMMUNG
DER
ZAHL
FREIER
CYSTEINRESTE
DER
DPPIV/CD26
88
5.3
ERSATZ
EINZELNER
CYSTEIN-RESTE
DURCH
SITE-DIRECTED-MUTAGENESIS
89
5.4
ZELLULAERE
LOKALISATION
DER
DPPIV/CD26-CYSTEIN-MUTANTEN
IN
STABIL
90
TRANSFIZIERTEN
FIBROBLASTEN
5.5
POSTTRANSLATIONALE
PROZESSIERUNG
DER
DPPIV/CD26-CYSTEIN
92
MUTANTEN
5.6
ENZYMAKTIVITAET
UND
AKTIVE
FORMEN
DER
DPPIV/CD26-CYSTEIN
95
MUTANTEN
5.7
DIMERISIERUNG
DER
DPPIV/CD26-CYSTEIN
MUTANTEN
97
5.8
NACHWEIS
DER
DPPIV/CD26-CYSTEIN-MUTANTEN
MIT
DEM
98
MONOKLONALEN
ANTIKOERPER
13.4
5.9
BESTIMMUNG
DER
HALBLEBENSZEITEN
DER
DPPIV/CD26-CYSTEIN
99
MUTANTEN
5.10
SCHLUSSFOLGERUNGEN
ZUR
DPPIV/CD26-SEKUNDAER/TERTIAERSTRUKTUR
100
5.11
AUSBLICK
101
6.
ZUSAMMENFASSUNG
103
ABSTRACT
106
INHALTSVERZEICHNIS
V
7.
ANHANG
107
7.1
ERGEBNISBERICHT
DES
FORSCHUNGSAUFENTHALTS
BEI
PROFESSOR
C.
107
MORIMOTO,
BOSTON
7.2
ABKUERZUNGEN
113
7.3
LITERATUR
113
7.4
VEROEFFENTLICHUNGEN
125
CURRICULUM
VITAE
DANK |
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