Multimere Inhibitoren der humanen Mastzell-Tryptase aus Hirudo medicinalis: Isolierung, Klonierung, Mutagenese und Charakterisierung
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1998
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| adam_text | S ABTEILUNG FUER KLINISCHE CHEMIE UND KLINISCHE BIOCHEMIE IN DER
CHIRURGISCHEN KLINIK UND POLIKLINIK, KLINIKUM INNENSTADT DER
LUDWIG-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET MUENCHEN VORSTAND: PROF. DR. HANS FRITZ
MULTIMERE INHIBITOREN DER HUMANEN MASTZELL- TRYPTASE AUS HIRUDO
MEDICINALIS: ISOLIERUNG, KLONIERUNG, MUTAGENESE UND CHARAKTERISIERUNG
DISSERTATION ZUM ERWERB DES DOKTORGRADES DER NATURWISSENSCHAFTEN AN DER
BIOLOGISCHEN FAKULTAET DER LUDWIG-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET MUENCHEN
VORGELEGT VON GABRIELE MATSCHINER AUS DACHAU 1998 INHALTSVERZEICHNIS
ZUSAMMENFASSUNG B B.1 B.2 B.3 B.4 B.4.1 B.4.2 B.S EINLEITUNG MASTZELLEN
UND IHRE PROTCASEN HUMANE MASTZELL-TRYPTASE REGULATION DER
TRYPTASE-AKTIVITAET INHIBITOREN DER HUMANEN MASTZELL-TRYPTASE LDTI
5D-LDTI AUFGABENSTELLUNG MATERIALIEN UND METHODEN C.1 C.1.1 C.L.1.1
C.1.1.2 C.1.1.3 C.1.1.4 C.1.1.5 C.L.1.6 C.1.2 C. 1.2.1 C. 1.2.2 C. 1.2.3
C. 1.2.3.1 C. 1.2.3.2 C. 1.2.3.3 C. 1.2.4 C.L.2.4.1 C. 1.2.4.2 C.
1.2.4.3 C.L.2.4.4 C.L.2.4.5 C.L.2.5 C.L.2.5.1 C. 1.2.5.2 C. 1.2.5.3
C.1.2.5.4 C.L.2.5.5 C.L.2.5.6 C.1.3 C.1.4 C.L.4.1 C.L.4.2 C.L.4.3 C.
1.4.4 C.L.4.5 MATERIALIEN GERAETE GERAETE FUER MIKROBIOLOGISCHE ARBEITEN
GERAETE FUER MOLEKULARBIOLOGISCHE ARBEITEN GERAETE FUER PROTEINCHEMISCHE
ARBEITEN GERAETE FUER ENZYMTESTS UND KINETISCHE MESSUNGEN GERAETE FUER DIE
CHROMATOGRAPHIE SONSTIGE GERAETE SUBSTANZEN UND MATERIALIEN
AUSGANGSMATERIALIEN ZUR ISOLIERUNG VON TRYPTASE-INHIBITOREN
CHROMATOGRAPHIEMEDIEN UND -SAEULEN MATERIALIEN FILR DIE PROTEINANALYTIK
PROTEINBESTIMMUNG ITNMUNOBLOTTING CHEMIKALIEN MATRERIALIEN FUER
ENZYMTESTS UND KINETISCHE MESSUNGEN ENZYME CHROMOGENE SUBSTRATE
FLUOROGENE SUBSTRATE REAGENZIEN FUER ACTIVE SITE TITRATIONEN SONSTIGE
MATERIALIEN MATERIALIEN FUER MOLEKULARBIOLOGISCHE ARBEITEN NAEHRMEDIEN UND
ZUSAETZE CHEMIKALIEN KITS VERBRAUCHSMATERIALIEN ENZYME SONSTIGE
MATERIALIEN BAKTERIENSTAEMME UND PLASMIDE OLIGONUKLEOTIDE ERST-STRANG
CDNA-SYNTHESE PRIMER, UNSPEZIFISCH PCR-PRIMER UNIVERSAL PCR PRIMER
SPEZIFISCH, DEGENERIERT PCR-PRIMER SPEZIFISCH SEQUENZIER-PRIMER 3 3 3 4
5 5 G 9 9 10 10 10 11 11 11 11 11 11 12 12 12 12 12 13 13 13 13 13 14 14
14 14 15 17 17 17 17 18 19 INHALTS VERZEICHNIS II C.2 C.2.1 C.2.1.1
C.2.1.2 C.2.1.3 C.2.1.4 C.2.1.5 C.2.1.6 C.2.1.7 C.2.2 C.2.2.1 C.2.2. L.L
C.2.2.1.2 C.2.2.1.3 C.2.2.1.4 C.2.2.1.5 C.2.2.1.6 C.2.2.1.7 C.2.2.2
C.2.2.3 C.2.2.4 C.2.2.4.1 C.2.2.4.2 C.2.2.4.3 C.2.2.4.4 C.2.3 C.2.4
C.2.4.1 C.2.4.2 C.2.5 C.2.5.1 C.2.5.2 C.2.5.3 C.2.5.4 C.2.5.4.1
C.2.5.4.2 C.2.5.4.3 C.2.5.5 C.2.5.6 C.2.6 C.2.7 C.2.7.1 C.2.7.2 C.2.8
C.2.8.1 C.2.8.2 C.2.8.3 C.2.8.4 C.2.8.4.1 C.2.8.4.2 C.2.8.5 C.2.8.5.1
C.2.8.5.2 C.2.8.6 C.2.8.6.1 METHODEN ISOLIERUNG UND REINIGUNG VON
INHIBITOREN FUER HUMANE MASTZELL-TRYPTASE AUS DEM MEDIZINISCHEN BLUTEGEL
HIRUCLO MEDICINALIS EXTRAKTION VON BLUTEGELN HITZEFAELLUNG
KATIONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE (FRACTOGEL-EMD SO3-)
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE (ANHYDROTRYPSIN-SEPHAROSE)
KATIONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE (MONO S)) BESTIMMUNG DER
PROTEINKONZENTRATION MESSUNG DER INHIBITORISCHEN AKTIVITAET GEGEN
TRYPTASE KLONIERUNG VON TRYPTASEINHIBITOREN AUS RIRUDO MEDICINALIS
PCR-KLONIERUNG VORBEREITUNG DER EGEL ZUR RNA-ISOLIERUNG RNA-ISOLIERUNG
NACH CHOMCYNSKI UND SACCHI ISOLIERUNG DER MRNA ERST-STRANG CDNA SYNTHESE
NESTED PCR MIT SPEZIFISCHEN, DEGENERIERTEN 5D-LDTI-PRIMERN LIGATION
DER PCR-PRODUKTE TRANSFORMATION UND DNA-SEQUENZIERUNG HERSTELLUNG EINER
CDNA-GENBANK AUS HIRUDO MEDICINALIS SCREENING DER CDNA GEN-BANK
KLONIERUNG VON 6D-LDTI-VARIANTEN PCR MIT 6D-LDTI CDNA ALS TEMPLATE
LIGATION DER PCR-PRODUKTE TRANSFORMATION VON E. COLI JM 109 ANALYSE VON
POSITIVEN KLONEN EXPRESSION DER MONIERTEN TRYPTASEINHIBITOREN IN E. COLI
REINIGUNG DER EXPREMIERTEN TRYPTASEINHIBITOREN ZELLERNTE UND AUFSCHLUSS
DER ZELLEN DURCH PERIPLASMAPRAEPARATION CHROMATOGRAPHISCHE AUFREINIGUNG
DER INHIBITOREN PROTEINCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER
TRYPTASEINHIBITOREN SDS-POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE(SDS-PAGE)
SILBERFAERBUNG VON POLYACRYLAMID GELEN FAERBUNG VON POLYACRYLAMID GELEN
MIT COOMASSIE BRILLIANT BLAU WESTERN BLOT-ANALYSE PROTEINTRANSFER AUF
PVDF-MEMBRAN BINDUNG DES SPEZIFISCHEN ANTIKOERPERS DETEKTION UEBER ENZYM
SUBSTRAT VERMITTELTE FARBREAKTION N-TERMINALE AMINOSAEURESEQUENZIERUNG
UMKEHRPHASEN-HPLC BESTIMMUNG DER STOECHIOMETRIE DER INHIBITION VON
PROTEASEN DURCH LDTI-VARIANTEN HEMMKINETISCHE CHARAKTERISIERUNG DER
INHIBITOREN BESTIMMUNG DER DISSOZIATIONSKONSTANTEN KI DER
ENZYM-INHIBITOR-KOMPLEXE UNTER GLEICHGEWICHTSBEDINGUNGEN ( STEADY-STALE
KINETIK) 19 19 19 20 20 20 21 21 21 22 22 22 23 23 24 24 24 25 25 26 26
26 27 27 27 27 28 28 28 28 28 29 30 30 30 31 31 31 31 32 32 32
BESTIMMUNG DER GESCHWINDIGKEITSKONSTANTEN DER GLEICHGEWICHTSEINSTELLUNG
( PRE-STEADY STATE -KINETIK) ALLGEMEINE MIKROBIOLOGISCHEN UND
MOLEKULARBIOLOGISCHEN METHODEN STAMMHALTUNG ANZUCHT UND VERMEHRUNG
MEDIEN UND ANTIBIOTIKA DNA ISOLIERUNG PUFFER UND LOESUNGEN FUER DAS
ARBEITEN MIT DNA PRAEPARATIVE ISOLIERUNG DER PLASMID-DNA AUS E. COLI
QUANTIFIZIERUNG VON DNA QUANTIFIZIERUNG DURCH AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE
QUANTIFIZIERUNG DURCH UV-SPEKTROSKOPIE IN VIFRO-ARBEITEN MIT DNA FAELLUNG
VON DNA MIT ETHANOL 35 37 37 38 38 38 38 38 39 39 39 40 40 INHALTS VER
ZEI CHNIS III C.2.8.6.2 AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE C.2.8.6.3 ISOLIERUNG
VON DNA AUS AGAROSEGELEN C.2.8.6.4 PHOSPHORYLIERUNG DER FREIEN 5 ENDEN
VON OLIGONUKLEORIDEN C.2.8.6.5 AMPLIFIKATION VON DNA MITTELS POLYMERASE
CHAIN REACTION (PCR) C.2.8.6.6 IDENTIFIKATION DER GEWUENSCHTEN KLONE
MITTELS KOLONIE-PCR C.2.8.6.7 DNA REINIGUNG MIT SIEBSAEULEN C.2.8.6.8
SPALTUNG VON DNA MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN C.2.8.6.9 LIGATION VON
DNA-FRAGMENTEN MIT UEBERHAENGENDEN ENDEN C.2.8.7 TRANSFORMATION VON E.
COLI MITTELS ELEKTROPORATION C.2.8.7.1 VORBEREITUNG DER ZELLEN C.2.8.7.2
TRANSFORMATION C.2.8.8 DNA-SEQUENZANALYSE 40 41 41 41 42 42 42 43 43 43
44 44 D D.1 D.L.L D.1.2 D.1.3 D.1.4 D.I.5 D.I.6 D.I.7 D.2 D.2.1 D.2.2
D.2.3 DJ D.3.1 D.3.1.1 D.3.1.2 D.3.1.3 D.3.1.4 D.3.2 D.4 D.4.1 D.4.2
D.4.3 D.4.4 D.4.5 D.4.6 D.5 D.6 D.6.1 D.6.2 D.6.3 D.7 D.7.1 D.7.2 D.7.3
ERGEBNISSE 45 ISOLIERUNG MULTIMERER TRYPTASE-INHIBITOREN AUS DEM
MEDIZINISCHEN BLUTEGEL HINIDO MEDICINALIS EXTRAKTION VON BLUTEGELN
HITZEFAELLUNG DIALYSE DES EXTRAKTES NACH HITZEFAELLUNG
KATIONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE (FRACTOGEIEMD-SO3-)
AFFINITAETS-CHROMATOGRAPHIE (ANHYDROTRYPSIN-SEPHAROSE)
KATIONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE (MONO S) UMKEHRPHASEN-HPLC
PROTEINCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER TRYPTASE-INHIBITOREN
SDS-POLYACRYLAMID GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) N-TERMINALE
AMINOSAEURESEQUENZIERUNG ESI-MASSENSPEKTROSKOPIE KLONIERUNG VON
TRYPTASEINHIBITOREN AUS HINIDO MEDICINALIS PCR-KLONIERUNG NESTED PCR
ZUR AMPLIFIKATION DER TRYPTASEINHIBITOREN -CDNA LIGATION DER
PCR-FRAGMENTE UND TRANSFORMATION VON COLI IDENTIFIZIERUNG VON
POSITIVEN KLONEN DNA-SEQUENZIERUNG DER ISOLIERTEN PLASMIDE HERSTELLUNG
UND SICHTEN EINER CDNA-GENBANK AUS HIRUDO MEDICINALIS KONSTRUKTION UND
EXPRESSION MULTIMERER VARIANTEN DES 6D-LDTT AMPLIFIKATION DES 6D-LDTI
AMPLIFIKATION VON 3 -DELETIONSVARIANTEN AMPLIFIKATION VON
5 -DE!ETIONSVARIANTEN AMPLIFIKATION DER EINZELDOMAENEN LIGATION IN DEN
PET 22B(+) VEKTOR TRANSFORMATION VON E.COLI UND IDENTIFIKATION POSITIVER
KLONE OPTIMIERUNG DER EXPRESSION VON LDTI-VARIANTEN IN E. COLI
EXPRESSION UND REINIGUNG DER EXPRIMIERTEN LDTI-VARIANTEN E. COLI -
PERIPLASMAPRAEPARATION KATIONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE (FRACTOGELOEMD
SO3-) UMKEHRPHASEN-HPLC PROTEINCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER
REKOMBINANTEN TRYPTASEINHIBITOREN SDS-PAGE WESTEMBLOT-ANALYSE
N-TERMINALE AMINOSAEURESEQUENZIERUNG 45 47 47 47 47 47 48 49 51 51 52 53
54 54 54 55 55 56 59 61 62 63 64 64 65 65 66 66 67 68 69 71 71 71 72
INHALTSVERZEICHNIS IV D.8 BESTIMMUNG DER STOECHIOMETRIE DER INTERAKTION
VON LDTI-VARIANTEN MIT PROTEASEN 73 D.8.1 TITRATION DER LDTI-VARIANTEN
MIT TRYPSIN 73 D.8.2 TITRATION DER LDTI-VARIANTEN MIT TRYPTASE 75 D.9
HEMMKINETISCHE CHARAKTERISIERUNG DER TRYPTASE-INHIBITOREN 77 D.9.1
HEMMUNG VON TRYPSIN (RIND) 77 D.9.1.1 ERMITTLUNG DER
GLEICHGEWICHTS-DISSOZIATIONSKONSTANTEN KI DES KOMPLEXES ( STEADY STATE -
KINETIK) 77 D.9.1.2 ERMITTLUNG DER GESCHWINDIGKEITSKONSTANTEN KON, UND
KOFF DER KOMPLEXBILDUNG UND - DISSOZIATION 79 D.9.2 HEMMUNG DER
MASTZELL-TRYPTASE 82 D.9.2.1 ERMITTLUNG DER
GLEICHGEWICHTS-DISSOZIATIONSKONSTANTEN KI DES KOMPLEXES NACH
GLEICHGEWICHTSEINSTELLUNG ( STEADY STATE -KINETIK) 82 D.9.2.2 ERMITTLUNG
DER GESCHWINDIGKEITSKONSTANTEN KON BZW. KOFF DER KOMPLEXBILDUNG BZW. -
DISSOZIATION ( PRE-STEADY STATE -KINETIK) 85 E DISKUSSION 88 NATUERLICHE
INHIBITOREN DER HUMANEN MASTZELL-TRYPTASE 88 IDENTIFIZIERUNG, ISOLIERUNG
UND CHARAKTERISIERUNG VON NEUEN TRYPTASE-INHIBITOREN AUS HINIDO
MEDICINALIS 89 IDENTIFIKATION UND KLONIERUNG VON CDNAS FUER MULTIMERE
LDTL-AEHNLICHE TRYPTASE- INHIBITOREN 90 KONSTRUKTION UND EXPRESSION VON
LDTI-VARIANTEN 94 HEMMKINETISCHE CHARAKTERISIERUNG DER MULTIMEREN
LDTI-VARIANTEN 95 AUSBLICK 97 F LITERATURVERZEICHNIS 98 G LEBENSLAUF 103
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| title_short | Multimere Inhibitoren der humanen Mastzell-Tryptase aus Hirudo medicinalis |
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| title_sub | Isolierung, Klonierung, Mutagenese und Charakterisierung |
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