Untersuchungen zum mikrotubuliabhängigen Organellentransport in Neurospora crassa: Charakterisierung von Mutanten in konventionellem Kinesin und zytoplasmatischem Dynein
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1999
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INHALTSVERZEICHNIS
L.EINLEITUNG
1
DAS
ZYTOSKELETT
UND ASSOZIIERTE
MOTOREN
ALS
GRUNDLAGE
FUER
BEWEGUNG
1
FILAMENTOESE
PILZE
ALS
MODELL
FUER
DEN
ORGANELLENTRANSPORT
6
AUFGABENSTELLUNG
UND
ZIELE
DER
VORLIEGENDEN
ARBEIT
7
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
9
2.1
REAGENTIEN,
ANTIKOERPER
UND
VERBRAUCHSMATERIAL
9
2.2
BIOLOGISCHES
MATERIAL
9
BAKTERIENSTAEMME,
MEDIEN,
ANZUCHT
UND
LAGERUNG
VON
BAKTERIEN
9
STAEMME,
KULTUR
UND
KONSERVIERUNG
VON
N.
CRASSA
9
2.3
BIOCHEMIE
10
2.3.1
ALLGEMEINE
BIOCHEMISCHE
METHODEN:
SDS-PAGE,
SILBERFAERBUNG,
WESTEM-BLOT
10
2.3.2
ISOLATION
VON
PROTEINEN
11
ISOLATION
UND
POLYMERISATION VON
TUBULIN
11
ISOLATION
VON
NKIN
12
ISOLATION
VON
MITOCHONDRIEN
13
ANREICHERUNG
EINES
MIT
DEM
ANTIKOERPER
MM44
KREUZREAGIERENDEN
PROTEINS
VONL20KD
14
HERSTELLUNG
EINES
PROTEINGESAMTEXTRAKTES
AUS
N.
CRASSA
14
2.3.3
MESSUNG
ENZYMATISCHER
AKTIVITAETEN
VON
NKIN
14
2.3.4
KONFORMATIONSAENDERUNGEN VON
NKIN
IM
DICHTEGRADIENTEN
15
2.4
MOLEKULARBIOLOGIE
15
2.4.1
MOLEKULARBIOLOGISCHES
ARBEITEN
MIT
N.
CRASSA
16
TRANSFORMATION
16
KREUZUNG
16
ISOLATION
VON
GENOMISCHER
DNA
UND
SOUTHEM-BLOT
17
ARBEITEN
MIT
RNA
17
VEREINZELUNG
UND
IN
VIVO
EXCISION
VON
BAKTERIENPHAGEN
18
2.4.2
VEKTOREN
FUER
DIE
NKIN
"DISRUPTION"
UND
DIE
KOMPLEMENTATION
DER
"RIP"-MUTANTE
18
2.4.3
PCR-SUCHE
NACH
WEITEREN
KINESINAEHNLICHEN
PROTEINEN
19
SPEZIFISCHE
PRIMER
ZUR
SEQUENZIERUNG
VON
NKIF
1
20
2.4.4
(HETEROLOGE)
EXPRESSION
VON
KINESINEN
UND
CHIMAEREN
IN
DER
"RIP
"
-MUTANTE
20
VERWENDETE
PRIMER
20
HERSTELLUNG
DER
KONSTRUKTE
22
VOLLAENGEN-KINESINE
22
SYNKIN/NKIN-CHIMAEREN
23
DM/NKIN-CHIMAEREN
24
MYC-NKIN
KONSTRUKTE
24
FLASH-NKIN/BLEO
25
2.4.5
FUSIONEN
MIT
GFP
25
2.4.6
NKIN-PUNKTMUTANTEN
26
2.4.7
DAS
"MINIMALKINESIN"
UND
PEPTIDE
IM
REZEPTORBINDUNGSBEREICH
27
2.5
MIKROSKOPIE
27
2.5.1
BEOBACHTUNG WACHSENDER
HYPHEN
UND
DER
ORGANELLENBEWEGUNG
28
2.5.2
IN
VIVO
FAERBUNG
VON
ORGANELLEN
28
2.5.3
IMMUNFLUORESZENZ
28
2.5.4
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
29
3.
ERGEBNISSE
30
3.1
INAKTIVIERUNG
VON
NKIN
UND
PHAENOTYPISCHE
ANALYSE
DER
"RIP"-MUTANTE
30
3.1.1
"RIP"
MUTAGANESE
DES
NKIN-GENS
30
3.1.2
PHAENOTYPISCHE
ANALYSE
31
MORPHOLOGISCHE
UND
PHYSIOLOGISCHE
CHARAKTERISTIKA
31
ORGANELLENBEWEGUNG
35
VERAENDERUNGEN
IM
SPITZENBEREICH
WACHSENDER
HYPHEN
36
UNTERSCHIEDE
IM
ZELLWANDAUFBAU
UND
DER
SEKRETION
38
KEMVERTEILUNG
40
3.2
FUNKTIONALE
ANALYSE
VON
NKIN
41
3.2.1
DIE
NKIN-VERTEILUNG
IN
DER
HYPHE
41
MYC-NKIN
FAERBUNGEN
42
3.2.2
CHARAKTERISIERUNG
WICHTIGER
SEQUENZABSCHNITTE
VON
NKIN
FTLR
EINE
OPTIMALE
FUNKTION
IN
VIVO
46
HETEROLOGE
EXPRESSION FREMDER
PILZKINESINE
IN
N.
CRASSA
47
ERFORDERT
SCHNELLES
WACHSTUM
EINEN
SCHNELLEN
MOTOR?
47
CHIMAERE
PILZKIESINE
48
3.2.3
REGULATORISCHE AUFGABEN
DER
"CARGO"-BINDUNGSDOMAENE
51
3.2.4
REGULATION
DER
MOTORDOMAENE
DURCH
DEN
C-TERMINUS
53
3.2.4
DIE
REZEPTORBINDUNGSDOMAENE
56
3.3.
WEITERE
MIKROTUBULIABHAENGIGE
MOTOREN
IN
N.
CRASSA
59
3.3.1
PROTEINE
DER
KINESIN-SUPERFAMILIE
60
PCR
MIT
DEGENERIERTEN
PRIMERN
60
KLPA
HOMOLOG
DER
KAR3/NCD
FAMILIE
60
HOMOLOG
DER
KIF
IFAMILIE
62
3.3.2
ZYTOPLASMATISCHES
DYNEIN
UND
DIE
ROL,
MIN-DOPPELMUTANTE
65
WACHSTUMSCHARAKTERISTIKA
DER
KINESIN-,
DYNEIN
UND
DOPPELMUTANTE
65
KEMVERTEILUNG
68
AUFTRETEN
EINES
SPITZENKOERPERS
68
ORGANELLENTRANSPORT
69
IMMUNLOKALISATION
VON
DYNEIN
UND
KOLOKALISATION
MIT
BREFELDIN
A
GEFAERBTEN
VESIKELN
72
4.
DISKUSSION
74
DIE
FUNKTION
VON
KINESIN
IN
FILAMENTOESEN
PILZEN
74
POTENTIELLE
INTERAKTIONEN
VON
NKIN
UND
DYNEIN
IN
N.
CRASSA
79
DIE ORIENTIERUNG
DES
MIKROTUBULI
ZYTOSKELETTS
IN
N.
CRASSA
82
ANALYSE
DES
NKIN
C-TERMINUS
83
AUSBLICK
86
S
.ZUSAMMENFASSUNG
87
6.
ANHANG
89
6.1
VERSUCHE
ZUR
IN
VIVO
MARKIERUNG
VON
NKIN
89
6.1.1
GFP
ALS
IN
VIVO
MARKER
89
GFP-NKIN
KONSTRUKTE
89
GFP-TUBULIN
KONSTRUKTE
90
GFP-NKIN
FUSIONEN
IN
A.
NIDULANS
90
6.1.2
IN
VIVO
MARKIERUNG
MITTELS
FLASH-EDT2
FAERBUNG
90
6.2
SEQUENZEN
DER
ISOLIERTEN
KINESINAEHNLICHEN
PROTEINE
93
6.1.1
NUKLEOTID
UND
ABGELEITETE
AMINOSAEURESEQUENZ
VON
NK1F1
93
6.2.2
DAS
AMPLIFIZIERTE FRAGMENT
AUS
DER
MOTORDOMAENE
DES
KLPA
HOMOLOGS
94
7.
LITERATUR
95
VI |
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