Genetische und molekulare Untersuchungen zur Funktion des Pax1-Gens der Maus:
Gespeichert in:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
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1999
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I
NHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN
V
1.
EINLEITUNG
1
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
24
2.1.
MATERIALIEN
24
2.1.1.
MAUSSTAEMME
24
2.1.2.
BAKTERIENSTAEMME
25
2.1.3.
ZELL-LINIEN
25
2.1.4.
VEKTOREN
UND
KONSTRUKTE
25
2.1.5.
DNA-BANKEN
26
2.1.6.
RADIATION
HYBRID-PANELS
26
2.1.7.
PRIMER
UND
KASSETTEN
26
2.1.8.
ELEKTRONISCHE
BILD
UND
SEQUENZVERARBEITUNG
27
2.2.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
ARBEITSMETHODEN
28
2.2.1.
DNA-PRAEPARATIONEN
28
2.2.1.1.
PLASMID-DNA
28
2.2.1.2.
BAC-DNA
28
2.2.1.3.
GENOMISCHE
MAUS-DNA
28
2.2.1.4.
GENOMISCHE
DNA
VON
ES-ZELLEN
29
2.2.2.
GELELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
DER
DNA
30
2.2.2.1.
PLASMID-UND
GENOMISCHE
DNA
30
2.2.2.2.
PFGE
BEI
BAC-DNA
30
2.2.3.
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSE-GELEN
30
2.2.4.
KLONIERUNG
31
2.2.5.
TRANSFORMATION
31
2.2.6.
SOUTHERN
BLOTS
31
2.2.7.
RADIOAKTIVE
UND
NICHT-RADIOAKTIVE
HYBRIDISIERUNGEN
VON
DNA-FILTEM
32
2.2.7.1.
RADIOAKTIVE
HYBRIDISIERUNGEN
VON
DNA-FILTEM
32
2.2.7.2.
NICHT-RADIOAKTIVE
HYBRIDISIERUNGEN
VON
DNA-FILTEM
33
2.2.8.
KLONIERUNG
DES
TARGETING-KONSTRUKTS
FUER
DEN
FAX?-KNOCK-OUT
33
2.2.9.
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
(PCR)
35
2.2.10.
ERSTELLEN
EINER
PHYSIKALISCHEN
KARTE
DER
POX/^'-DELETION
MIT
HILFE
VON
BAC-KLONEN
41
I
NHALTSVERZEICHNIS
2.2.10.1.
HERSTELLUNG
VON
SUBKLONEN
DER
BAC-ENDEN
42
2.2.10.2.
AMPLIFIZIERUNG
DER
BRUCHPUNKTE
DER
PAXL
V
"'
S
-
UND
PAXL
"
"'
"
-
DELETIONEN
IN
EINEM
INVERSEN
ANSATZ
DURCH
'
NESTED
PCR
'
42
2.3.
ES-ZELL-TECHNIK,
MORULA-AGGREGATION
UND
HERSTELLUNG
VON
PAX7"
"
"-MUTANTEN
MAEUSEN
44
2.3.1.
MATERIALIEN
44
2.3.2.
ANZUCHT
VON
FEEDERZELLEN
44
2.3.3.
KULTUR
VON
ES-ZELLEN
DER
LINIE
RI
45
2.3.4.
ELEKTROPORATION
45
2.3.5.
POSITIV-NEGATIV-SELEKTION
MIT
GENETICIN
(G4
18)
UND
GANCYCLOVIR
46
2.3.6.
ISOLIERUNG
DER
UEBERLEBENDEN
KLONE
UND
SCREENING
47
2.3.7.
MORULA-AGGREGATION
48
2.4.
PROTEINBIOCHEMISCHE
METHODEN
50
2.4.1.
PRAEPARATION
VON
GESAMTPROTEIN
AUS
EMBRYONALEM
GEWEBE
50
2.4.2.
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
50
2.4.3.
PROTEINTRANSFER
AUF
MEMBRANEN
51
2.4.4.
WESTERN
BLOT-ANALYSE
52
2.5.
PHAENOTYPISCHE
AUSWERTUNG
DER
MAEUSE
53
2.5.1.
SKELETTPRAEPARATIONEN
VON
NEUGEBORENEN
MAEUSEN
53
2.5.2.
BETAEUBUNG
VON
LEBENDEN
MAEUSEN
FUER
DIE
FOTOGRAFISCHE
DOKUMENTATION
53
3.
ERGEBNISSE
54
3.1.
HERSTELLUNG
DER
PAX7-NULL-MUTANTE
PAXL"
""
UND
PHAENOTYPISCHE
ANALYSE
DES
SKELETTS
54
3.1.1.
GENE-TARGETING
DES
PAXL
-GENS
54
3.1.2.
WESTERN
BLOT-ANALYSE
VON
PAX7""
,,
-EMBRYONEN
58
3.1.3.
PHAENOTYPISCHE
ANALYSE
DES
SKELETTS
VON
PAX7"
"
"-MAEUSEN
60
3.1.3.1.
HETEROZYGOTE
PAX7
"
"-NEUGEBORENE
60
3.1.3.2.
HOMOZYGOTE
PAX7"
"
"-NEUGEBORENE
61
3.2.
ANALYSE
DER
SKELETTPHAENOTYPEN
DER
UNDULATED-MATANTEN
PAXL
"
",
PAXL
"
"'
"
UND
PAXL"""
68
3.2.1.
SKELETTMISSBILDUNGEN
BEI
PAX7
"
"-MUTANTEN
TIEREN
68
3.2.1.1.
HETEROZYGOTEPAX7
"
N
-NEUGEBORENE
68
3.2.1.2.
HOMOZYGOTE
PAXL^-NEUGEBORENE
69
3.2.2.
SKELETTMISSBILDUNGEN
BEI
PAX7
""
'
"
-MUTANTEN
TIEREN
70
3.2.2.1.
HETEROZYGOTE
PAX7
"
"
"
-NEUGEBORENE
70
3.2.2.2.
HOMOZYGOTEPAX7
""
'
"
-NEUGEBORENE
70
3.2.3.
SKELETTMISSBILDUNGEN
BEI
PAXL^
'
-MUTANTEN
TIEREN
74
II
I
NHALTSVERZEICHNIS
3.2.3.1.
HETEROZYGOTE
PAX7""'
S
-NEUGEBORENE
74
3.2.3.2.
HOMOZYGOTEPAX?
""'-NEUGEBORENE
75
3.3.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
REDUNDANZ
ZWISCHEN
PAXL
UND
PAX9
AN
PAXL"
"
,,
IPAX9
F
'
"
Z
-
MUTANTEN
MAEUSEN
82
3.3.1.
ERSTELLUNG
VON
PAX7"
"
"-PAX9'"
Z
-DOPPELMUTANTEN
DER
MAUS
82
3.3.2.
PHAENOTYPISCHE
ANALYSE
DES
AXIALSKELETTS
BEI
PAX7"
"
"/POX9
Z
"
CZ
-MUTANTEN
MAEUSEN
83
3.4.
ERSTELLEN
EINER
PHYSIKALISCHEN
KARTE
UND
GENOMISCHE
ANALYSE
DER
DELETIONS
ALLELE
PAXL
U
'
S
UND
PAXR
"
93
3.4.1.
IDENTIFIZIERUNG
VON
BAC-KLONEN,
DIE
DEN
GENLOKUS
VON
PAXL
ENTHALTEN
93
3.4.2.
IDENTIFIZIERUNG
VON
BAC-KLONEN,
DIE
MIT
BAC
132
UND
BAC
213
UEBERLAPPEN
94
3.4.3.
CHARAKTERISIERUNG
DER
PAXL
""
''-DELETION
99
3.4.4.
CHARAKTERISIERUNG
DER
PAX7
"
"
"-DELETION
104
3.5.
SUCHE
NACH
GENEN,
DIE
INNERHALB
DER
PAXL
""
'-DELETION
LIEGEN
UND
AM
SPEZIFISCHEN
PHAENOTYP
BETEILIGT
SEIN
KOENNTEN
110
3.5.1.
BAC-TRANSGENE
MAEUSE
UND
DER
VERSUCH
DER
RETTUNG
DES
POX7""
'-SPEZIFISCHEN
PHAENOTYPS
110
3.5.2.
KARTIERUNG
DES
HUMANEN
PAX1
UND
EINES
BENACHBARTEN
TRANSKRIPTES
111
4.
DISKUSSION
115
4.1.
DAS
GENE-TARGETING
VON
PAXL
RESULTIERT
IN
EINEM
NULL-ALLEL
117
4.2.
MOEGLICHE
MECHANISMEN
DER
TRANSKRIPTIONS
UND
TRANSLATIONSREGULATION
VON
PAXL
118
4.3.
PAXL
ZEIGT
HAPLOINSUFFIZIENZ
IN
SKELETTELEMENTEN
DER
WIRBELSAEULE
UND
DES
BRUSTBEINS
119
4.4.
PHAENOTYPISCHE
KLASSIFIZIERUNG
DER
UNDULATED-ALLELE
MIT
HILFE
DES
POX7
"
"
"-ALLELS
121
4.4.1.
PAXL'"'
IST
EIN
HYPOMORPHES
ALLEL
121
4.4.2.
PAX!
"
"
"
IST
EIN
NATUERLICHES
NULL-ALLEL
123
4.4.3.
DIE
PAXL
""
'-MUTATION
RUFT
EINEN
SPEZIFISCHEN
PHAENOTYP
HERVOR,
DER
SICH
DEUTLICH
VON
DEN
PHAENOTYPEN
DER
UEBRIGEN
PAX7-ALLELE
UNTERSCHEIDET
125
4.5.
RUECKSCHLUESSE
VOM
PHAENOTYP
DER
PAX7"
"
"-MUTANTEN
MAEUSE
AUF
DIE
FUNKTION
VON
PAXL
BEI
DER
ENTSTEHUNG
DER
WIRBELSAEULE,
DES
BRUSTBEINS
UND
DES
SCHULTERGUERTELS
127
4.5.1.
DIE
ROLLE
VON
PAXL
BEI
DER
ENTSTEHUNG
DER
WIRBELSAEULE
127
4.5.2.
DIE
ROLLE
VON
PAXL
BEI
DER
ENTSTEHUNG
DES
BRUSTBEINS
136
4.5.3.
DIE
ROLLE
VON
PAXL
BEI
DER
ENTSTEHUNG
DES
SCHULTERGUERTELS
139
M
I
NHALTSVERZEICHNIS
4.5.4.
PAXL
SPIELT
ALS
MORPHOGEN
EINE
WICHTIGE
ROLLE
BEI
DER
ENTSTEHUNG
VON
KNORPELIGEN
ELEMENTEN
143
4.6.
PAXL
UND
PAX9
HABEN
REDUNDANTE
FUNKTIONEN
BEI
DER
ENTSTEHUNG
DER
WIRBELSAEULE
UND
SIND
ESSENTIELL
FUER
DIE
AUSBILDUNG
VON
WIRBELKOERPEM
UND
ZWISCHENWIRBELSCHEIBEN
144
4.6.1.
PAXL
UND
PAX9
WERDEN
BENOETIGT
FUER
DIE
AUSBILDUNG
VENTRALER
STRUKTUREN
IM
AXIALSKELETT
144
4.6.2.
PAX
1
UND
PAX9
SIND
UNERLAESSLICH
FUER
DIE
PROLIFERATION
VON
FRUEHEN
SKLEROTOMZELLEN
148
4.7.
DIE
UNDULATED
SHORT-TAIL
(POX/^L-MUTATION
UNTERSCHEIDET
SICH
DEUTLICH
VON
DER
POXF-NULL-MUTATION
150
4.7.1.
GEGENLAEUFIGE
EFFEKTE
DER
PAXL
""
"
-MUTATION
AUF
ZELLPROLIFERATION
UND
KONDENSATION
IN
DER
WIRBELSAEULE
UND
IM
SCHULTERGELENK
150
4.7.2.
VERSUCHE
ZUR
IDENTIFIZIERUNG
DES
/
DER
PAXL
""
"
-SPEZIFISCHEN
GENE
153
4.8.
AUSBLICK
154
5
.ZUSAMMENFASSUNG
155
6.
LITERATURVERZEICHNIS
157
IV |
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