Funktionelle Expression eines humanen, MBP-spezifischen T-Zell-Rezeptors in Maus-Hybridomzellen:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
[1998]
|
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | VI, 157 S. Ill., graph. Darst. |
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
L
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
1
IL
EINLEITUNG
.
5
1.
ANTIGENPRAESENTATION
IM
IMMUNSYSTEM
.
5
2.
MHC-MOLEKUELE
.
6
2.1.
ANTIGEN-PROZESSIERUNG
DURCH
MHC-KLASSE-I
UND
KLASSE-D-MOLEKUELE
.
6
2.2.
STRUKTUR
DER
MHC-MOLEKUELE
.
7
3.
STRUKTUR
DES
T-ZELL-REZEPTOR-KOMPLEXES
.
8
4.
DER
TERNAERE
KOMPLEX
AUS
MHC-MOLEKUEL,
PEPTID
UND
T-ZELL-REZEPTOR
.
10
5.
MODELLE
FUER
DIE
T-ZELL-REZEPTOR-AKTIVIERUNG
.
14
6.
T-ZELL-AKTI
VIERUNG
.
15
7.
DIE
ROLLE
VON
T-ZELLEN
IN
AUTOIMMUNERKRANKUNGEN
.
17
HI.
AUFGABENSTELLUNG
.
19
1.
GRUNDLAGEN
.
19
2.
FRAGESTELLUNG.
.
19
IV.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
21
1.
GERAETE
.
21
2.
MATERIAL
.
22
2.1.
CHEMIKALIEN
UND
VERBRAUCHSMATERIAL
.
22
22.
ZELLKULTUR-REAGENZIEN
.
24
2.3.
ANTIBIOTIKA
.
24
2.4.
ENZYME
.
24
2.5.
ANTIKOERPER
.
25
2.6.
DNA-VEKTOREN
.
26
2.7.
OLIGONUKLEOTIDE
.
26
2.8.
DNA-GROESSENSTANDARDS
.
29
2.9.
BAKTERIENSTAEMME
.
30
2.10.
EUKARYONTISCHE
ZELLEN
.
30
3.
METHODEN
.
31
3.1.
MIKROBIOLOGISCHE
METHODEN
.
31
INHALTSVERZEICHNIS
3.1.1.
ANZUCHT
VON
BAKTERIEN
.
31
3.1.2.
KONSERVIERUNG
VON
BAKTERIEN-STAEMMEN
.
31
3.2.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
32
3.2.1.
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
VON
PLASMID-DNA
.
32
3.2.1.1.
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
IM
ANALYTISCHEN
MABSTAB
.
32
3.2.1.2.
PLASMID-ISOLIERUNG
IM
PRAEPARATIVEN
MASSSTAB
.
32
3.2.I.3.
REINIGUNG
VON
DNA
DURCH
PHENOLEXTRAKTION
UND
ETHANOLFAELLUNG
.
33
3.2.1.4.
BESTIMMUNG
VON
DNA-KONZENTRATIONEN
.
34
3.2.2.
GESAMT-RNA-ISOLIERUNG
UND
CDNA-HERSTELLUNG
AUS
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
.
34
3.2.2.1.
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
AUS
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
.
.
34
3.2.2.2.
ERSTSTRANG-CDNA-SYNTHESE
DURCH
REVERSE
TRANSKRIPTION
VON
MRNA.
.
35
3.2.3.
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
.
36
3.2.3.1.
AMPLIFIZIERUNG
VON
DNA-SEQUENZEN
UEBER
PCR.
.
36
3.2.3.2.
IN-VITRO-MUTAGENESE
UEBER
PCR
.
37
3.2.4.
GELELEKTROPHORETISCHE
ANALYSE
VON
DNA
.
37
3.2.4.I.
ANALYSE
VON
DNA
IN
AGAROSEGELEN
.
37
3.2.4.2.
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
DURCH
ELEKTROELUTION
.
39
3.2.4.3.
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
MIT
DEM
BIOTRAP
ELEKTROSEPARATIONSSYSTEM.
.
39
3.2.4.4.
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
MIT
DEM
QIAEXII
KIT
.
40
3.2.4.5.
REINIGUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
HILFE
DES
QIAQUICK-PCR-PURIFICATION
KITS
.
40
3.2.5.
KLONIERUNG
VON
DNA.
.
41
3.2.5.1.
SPALTUNG
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
41
3.2.5.2.
AUFFUELLEN
UEBERHAENGENDER
5'-ENDEN
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
42
3.2.5.3.
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
5-ENDEN
.
42
3.2.5.4.
LIGATION
VON
DNA-MOLEKUELEN
.
43
3.2.6.
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
BAKTERIENZELLEN
UEBER
ELEKTROPORATION
.
44
3.2.6.I.
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
BAKTERIEN
FUER
DIE
ELEKTROTRANSFORMATION
.
44
3.2.6.2.
ELEKTROTRANSFORMATION
VON
BAKTERIENZELLEN
.
44
3.2.6.3.
BESTIMMUNG
DER
TRANSFORMATIONSRATE
VON
BAKTERIEN
FUER
DIE
ELEKTROTRANSFORMATION
.
45
3.2.7.
NICHT-RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA
MIT
HILFE
DES
DIG-SYSTEMS
.
45
3.2.7.X.
MARKIERUNG
VON
DNA-OLIGONUKLEOTIDEN
MIT
DIG-MARKIERTEN
NUKLEOTIDEN.
45
N
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.8.
HYBRIDISIERUNGSMETHODEN
.
46
3.2.8.1.
SOUTHERN-TRANSFER
.
46
32.8.1.1.
UEBERTRAGUNG
VON
DNA
AUF
NYLONFILTER
DURCH
EINEN
SOUTHEM-TRANSFER
.
46
32.8.1.2.
DNA-DNA-HYBRIDISIERUNG
AN
NYLONMEMBRANEN
NACH
EINEM SOUTHEM
TRANSFER
.
47
3.2.8.2.
KOLONIEHYBRIDISIERUNG
.
48
3.2.8.2.I.
UEBERTRAGUNG
VON
BAKTERIENKOLONIEN
AUF
NYLONMEMBRANEN
MIT
ANSCHLIESSENDER
DNA-FIXIERUNG
.
49
32.8.2.2.
DNA-DNA-HYBRIDISIERUNG
BEI
KOLONIEHYBRIDISIERUNGEN
.
49
3.2.9.
DNA
SEQUENZIERUNG
.
50
32.9.1.
HERSTELLUNG
VON
SEQUENZGELEN
.
50
3.2.9.2.
DURCHFUEHRUNG
DER
SEQUENZIERUNGSREAKTION
.
51
3.2.10.
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
LOWRY
.
52
3.3.
ZELLBIOLOGISCHE
METHODEN
.
53
3.3.1.
ZELLKULTUR
.
53
3.3.1.1.
KULTIVIERUNG
HUMANER
T-ZELLEN
.
53
3.3.1.1.1.
ISOLIERUNG
VON
PERIPHEREN
BLUTLYMPHOZYTEN
.
53
3.3.1.1.2.
KULTIVIERUNG
DER
T-ZELLINIEN
.
54
3.3.1.2.
KULTUR
VON
SUSPENSIONSZELLEN
.
55
3.3.1.3.
KULTUR
VON
ADHAERENT
WACHSENDEN
ZELLEN
.
55
3.3.2.
BESTIMMUNG
DER
ZELLZAHL
.
56
3.3.3.
BSA-GRADIENT
.
56
3.3.4.
EINFRIEREN
UND
AUFTAUEN
VON
ZELLEN
.
57
3.3.5.
TRANSFEKTION
EUKARYONTISCHER
ZELLEN
MIT
DNA
.
57
3.3.5.1.
TRANSFEKTION
MIT
DEM
LIPOFECTAMINEYY-REAGENZ
.
58
3.3.5.2.
TRANSFEKTION
UEBER
ELEKTROPORATION
.
59
33.5.2.1.
UEBERPRUEFUNG
DES
ELEKTROPORATIONSVERFAHRENS
.
59
33.5.2.1.1.
TRANSFEKTION
DES
LUCIFERASE-GENS
.
59
33.5.2.1.2.
TRANSIENTE
EXPRESSION
DES
"GREEN
FLUORESCENT
PROTEIN"
.
60
33.5.2.2.
DURCHFUEHRUNG
DER
ELEKTROPORATION
.
60
33.5.3.
SELEKTION
DER
TRANSFIZIERTEN
ZELLEN
.
61
3.3.53.1.
BESTIMMUNG
DER
ANTIBIOTIKA-KONZENTRATION
ZUR
SELEKTION
VON
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
.
61
3.3.53.2.
SELEKTION
DER
TRANSFIZIERTEN
ZELLEN
.
62
33.5.4.
Y-IFN-BEHANDLUNG
NACH
DER
TRANSFEKTION
MIT
PHSE3'-VEKTOREN
.
63
3.3.6.
FACS-ANALYSE
.
63
IN
INHALTSVERZEICHNIS
3.3.7.
ANREICHERUNG
VON
ZELLEN
.
64
3.3.7.I.
ZELLANREICHERUNG
MIT
HILFE
DES
FACSORT-GERAETES
.
64
3.3.7.Z.
ZELLANREICHERUNG
OBER
MACS
.
65
3.3.8.
AKTIVIERUNG
DER
TRANSFEKTANTEN
.
65
3.3.8.I.
UNPHYSIOLOGISCHE
AKTIVIERUNG
DER
TRANSFEKTANTEN
.
66
3.3.8.2.
SPEZIFISCHE
AKTIVIERUNG
DER
TRANSFEKTANTEN
UEBER
MHC/PEPTID-KOMPLEXE
.
67
3.3.8.3.
INTERLEUKIN-2-ELISA.
.
67
V.
ERGEBNISSE
.
69
1.
KLONIERUNG
DER
REKOMBINANTEN
TZR-SEQUENZEN
IN
EXPRESSIONSVEKTOREN
.
69
1.1.
KLONIERUNGSSTRATEGIE
.
69
1.2.
HERSTELLUNG
DES
VEKTORS
PBRDEL
ZUR
SUB
UND
KASSETTENKLONIERUNG
.
70
1.3.
TEST
DER
ZELLINIEN
IM15
UND
ER3
AUF
KREUZREAKTIVITAET
.
72
1.4.
KLONIERUNG
DER
TZR-A
UND
TZR-SS-KETTEN
DER
T-ZELLKLONE
IM1
5
UND
ER3
.
74
1.4.1.
MODIFIKATIONEN
DER
IM15
UND
ER3-TZR-SEQUENZEN
IM
RAHMEN
DER
RT
PCR-AMPLIFIKATION
.
74
1.4.2.
KLONIERUNG
DER
HUMANEN
TZR-MOLEKUELE
.
75
I.4.2.I.
KLONIERUNG
DER
HUMANEN
TZR-A-KETTEN
DER
ZELLINIEN
IM15
UND
ER3
.
75
I.4.2.2.
KLONIERUNG
DER
HUMANEN
TZR-SS9.1-KETTE
.
77
1.4.3.
KONSTRUKTION
VON
CHIMAEREN
TZR-MOLEKUELEN
IM
VEKTOR
PBRDEL
.
78
1.4.3.1.
KONSTRUKTION
DER
CHIMAEREN
IM15-UND
ER3-TZR-A-KETTEN
.
78
1.4.3.2.
KONSTRUKTION
DER
CHIMAEREN
TZR-B9.
1
-KETTE
.
79
1.4.4.
KONSTRUKTION
VON
MUTAGENISIERTEN
TZR-KETTEN
UEBER
PCR-IN-VITRO
MUTAGENESE
.
80
1.4.4.1.
EINFUEHRUNG
VON
PUNKTMUTATIONEN
IN
DEN
CDRI-UND
CDR3-REGIONEN
DER
IM15-TZR-A-KETTE
.
81
1.5.
KLONIERUNG
DER
TZR-MOLEKUELE
IN
EUKARYONTISCHE
EXPRESSIONSVEKTOREN
.
83
1.5.1.
PHSE3'-VEKTOREN
.
83
1.5.1.1.
KONSTRUKTION
DER
VEKTOREN
PHSE3
'
NEO
UND
PHSE3
'
HYGRO
.
84
1.5.1.1.1.
KONSTRUKTION
DES
VEKTORS
PHSES'NEO
.
84
1.5.1.1.2.
KONSTRUKTION
DES
VEKTORS
PHSESHYGRO
.
86
1.5.1.2.
KLONIERUNG
DER
TZR-KETTEN
IN
DIE
PHSE3'-EXPRESSIONSVEKTOREN
.
89
1.5.2.
PIRES-EXPRESSIONS-VEKTOR
.
89
I.5.2.I.
AUFBAU
DES
PIRES-VEKTORS
.
89
I.5.2.2.
KLONIERUNG
DER
TZR-KETTEN
IN
DEN
PIRES-VEKTOR
.
90
IV
INHALTSVERZEICHNIS
1.5.3.
KLONIERUNG
DER
TZR-B9.1-KETTE
IN
DEN
PREP9-EXPRESSIONSVEKTOR
.
93
1.5.3.1.
AUFBAU
DES
PREP9-VEKTORS
.
93
1.5.32.
KLONIERUNG
DER
TZR-B9.
1
-KETTE
IN
DEN
PREP9-EXPRESSIONSVEKTOR
.
93
1.5.4.
KLONIERUNG
DER
TZR-MOLEKUELE
IN
RSV5-VEKTOREN
.
94
1.5.4.1.
AUFBAU
DER
RSV5-VEKTOREN
.
94
I.5.4.2.
KLONIERUNG
DER
TZR-MOLEKUELE
IN
DIE
VEKTOREN
RSV5NEO
UND
RSV5HYGRO.
94
2.
TRANSFEKTION
DER
TZR-MOLEKUELE
IN
EUKARYONTISCHE
T-ZELLINIEN
.
95
2.1.
TRANSFEKTIONSPARAMETER
.
96
2.1.1.
UEBERPRUEFUNG
DER
ELEKTROPORATIONSPARAMETER
MIT
DEM
LUCIFERASE-TEST
.
96
2.12.
TRANSFEKTION
DER
JURKAT-ZELLEN
UND
DES
HYBRIDOMS
5
8A
'
SS
'
MIT
PEGFP-N2
.
97
2.1.3.
EINFLUSS
VON
VERSCHIEDENEN
FKS-CHARGEN
AUF
DIE
SELEKTION
VON
HYBRIDOMZELLEN
NACH
DER
TRANSFEKTION
.
99
2.1.4.
TEST
VON
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERN
ZUR
DETEKTION
DER
OBERFLAECHEN
EXPRESSION
VON
TZR-MOLEKUELEN
.
99
22.
TRANSFEKTION
DER
TZR-MOLEKUELE
IN
JURKAT
UND
IN
58A
'
SS'-ZELLEN
.
102
2.2.1.
TRANSFEKTION
DER
TZR-MOLEKUELE
IN
MUTANTEN
DER
T-ZELL-LYMPHOMLINIE
JURKAT
.
102
22.1.1.
STRATEGIE
DER
TRANSFEKTIONSEXPERIMENTE
.
102
22.1.2.
ERGEBNISSE
DER
TRANSFEKTIONS-EXPERIMENTE
.
103
2.2.12.1.
TRANSFEKTION
DER
JURKAT-MUTANTEN
MIT
PHSE3'-VEKTOREN
.
103
2.2.1.2.2.
TRANSFEKTION
DER
JURKAT-MUTANTEN
MIT
RSV5-,
PIRES
UND
PREP9
VEKTOREN
.
106
22.1.2.3.
ZUSAMMENFASSUNG
DER
TRANSFEKTIONS-EXPERIMENTE
IN
DEN
JURKAT
MUTANTEN
.
109
2.2.2.
TRANSFEKTION
DER
REKOMBINANTEN
TZR-MOLEKUELE
IN
DAS
MAUS-HYBRIDOM
58A'SS"
.
.
.
HO
2.22.1.
ERGEBNISSE
DER
5
8A'SS
'
-TRANSFEKTIONSEXPERIMENTE
.
HO
2.22.1.1.
TRANSFEKTION
DER
58A'SS
'
-ZELLEN
MIT
PHSE3'-UND
PIRES-VEKTOREN
.
110
2.2.2.12.
TRANSFEKTION
DER
58A'SS
'
-ZELLEN
MIT
RSV5-VEKTOREN
.
111
2.22.1.3.
CHARAKTERISIERUNG
DER
STABILEN
IM15-TZR-TRANSFEKTANTEN
UEBER
DIE
PRODUKTION
VON
IL-2
.
115
2.22.1.3.1.
U.-2-PRODUKTION
NACH
DER
UNPHYSIOLOGISCHEN
AKTIVIERUNG
DERTRANSFEKTANTEN
MIT
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERN
.
115
2.22.1.3.2.
IL-2-PRODUKTION
NACH
DER
SPEZIFISCHEN
AKTIVIERUNG
DES
KLONS
I
MIT
DEM
MBP-PEPTID
(139-151)
.
116
V
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.2.1.3.3.
IL-2-PRODUKTION
NACH
DER
SPEZIFISCHEN
AKTIVIERUNG
DES
KLONS
1
MIT
MBP
PEPTID-DERIVATEN
.
118
22.2.2.
ZUSAMMENFASSUNG
DER
TRANSFEKTIONS-EXPCRIMENTE
IN
DEN
MAUS-T-ZELL
HYBRIDOMZELLEN
58A'SS'
.
122
VL
DISKUSSION
.
125
1.
KLONALITAET
DER
AUSGANGSZELLINIEN
.
125
2.
TRANSFEKTIONSEXPERIMENTE
.
126
2.1.
WAHL
DER
ZIELZELLEN
.
126
2.2.
ETABLIERUNG
EINES
GEEIGNETEN
TRANSFEKTIONSVERFAHRENS
.
127
2.3.
TRANSFEKTION
DER
JURKAT-ZELLEN
.
129
2.3.1.
INSTABILITAET
DER
JURKAT-ZELLEN
.
129
2.3.2.
EINFLUSS
DER
EXPRESSIONSVEKTOREN
.
130
2.32.1.
TRANSFEKTION
MIT
PHSE3
'
-EXPRESSIONSVEKTOREN
.
130
2.32.2.
TRANSFEKTION
MIT
PIRES-VEKTOREN
.
131
2.32.3.
TRANSFEKTION
MIT
RSV5-UND
PREP9-EXPRESSIONSVEKTOREN
.
131
2.4.
TRANSFEKTION
DER
58A
'
SS'
-ZELLEN
.
132
2.4.1.
INSTABILITAET
DER
58A'SS'-ZELLEN
.
132
2.4.2.
TRANSFEKTION
MIT
PHSE3
'
-EXPRESSIONSVEKTOREN
.
133
2.4.3.
TRANSFEKTION
MIT
PIRES-EXPRESSIONSVEKTOREN
.
133
2.4.4.
TRANSFEKTION
MIT
RSV5-EXPRESSIONS-VEKTOREN
.
134
2.4.4.I.
CHARAKTERISIERUNG
DER
IM15-TZR-TRANSFEKTANTEN
.
134
2.4.42.1.
FACS-FAERBUNGEN.
.
134
2.4.4.22.
UNPHYSIOLOGISCHE
AKTIVIERUNG
DER
IM15-TZR-TRANSFEKTANTEN
MIT
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERN
.
134
2.4.42.3.
SPEZIFISCHE
AKTIVIERUNG
DES
IM15-TZR-TRANSFEKTANTEN-KLONS
DURCH
DAS
MBP-PEPTID
(139-151)
.
135
2.4.42.4.
FEINSPEZIFITAETSUNTERSUCHUNGEN
DES
IM15-TZR-TRANSFEKTANTEN-KLONS
.
136
3.
AUSBLICK
.
138
VII.
ZUSAMMENFASSUNG
.
141
VM.
LITERATURVERZEICHNIS
.
143
IX.
DANKSAGUNG
.
155
X.
VERSICHERUNG
.
156
XL
LEBENSLAUF.
.
157
VI |
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