Punktmutationen im aktiven Zentrum der 6-Phospho-b-Galaktosidase aus Lactococcus lactis:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
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1999
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| Beschreibung: | Bochum, Univ., Diss., 1999 |
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1
EINLEITUNG
.
1
1.1
GLYKOSIDASEN
.
1
1.1.1
EINTEILUNG
DER
GLYKOSIDASEN
.
2
1.1.2
DIE
FAMILIE
1
DER
GLYKOSIDASEN
.
3
1.1.3
DIE
FALTUNG
DER
ENZYME
DER
FAMILIE
1
.
6
1.14
DER
MECHANISMUS
DER
KATALYSE
BEI
GLYKOSIDASEN
.
7
1.2
DIE
6-PHOSPHO-SS-GALAKTOSIDASEN
.
10
1.2.1
DIE
PHYSIOLOGISCHE
FUNKTION
DER
6-PHOSPHO-SS-GALAKTOSIDASEN
IM
BAKTERIELLEN
STOFFWECHSEL/
DAS
PTS
.
10
1.2.2
DIE
STRUKTUR
DER
6-PHOSPHO-SS-GALAKTOSIDASE
VON
LACTOCOCCUS
LACTIS
.
13
1.2.2
1
DAS
AKTIVE
ZENTRUM
.
14
1.2.3
VERGLEICH
DER
6-PHOSPHO-SS-GALAKTOSIDASE
VON
LACTOCOCCUS
LACTIS
UND
DER
CYANOGENEN
SS
GLUKOSIDASE
VON
TRIFOLIUM
REPENS
.
16
2
AUFGABENSTELLUNG
.
18
3
MATERIAL
UND
METHODEN
.
19
3
1
MATERIAL
.
19
3.1.1CHEMIKALIEN
UND
ENZYME
.
19
3.1.2
BAKTERIEN
UND
PLASMIDE
.
20
3.1.3
NAEHRMEDIEN
.
20
3.2
METHODEN
.
22
3
2.1
MOLEKULARBIOLOGISCHE
TECHNIKEN
.
22
3.2.1.1
ORTSSPEZIFISCHE
MUTAGENESE
.
22
3.2
1.1.1
ECKSTEIN-MUTAGENESE
.
22
3.2.1.1.2
ORTSSPEZIFISCHE
MUTAGENESE
DURCH
POLYMERASEKETTENREAKTION
.
23
3.2
1.2
DNA-SEQUENZIERUNG
.
24
3.2.2
BIOCHEMISCHE
METHODEN
.
24
3.2.2.1
PROTEINREINIGUNG.
UEBEREXPRESSION
UND
REINIGUNG
DER
6-PHOSPHO-SS-GALAKTOSIDASE
ALS
WILDTYP
ODER
MUTANTENPROTEIN
(NACH
KRUEGER,
1988)
.
24
3.2.2.1.1
ANZUCHT
UND
INDUKTION
VON
BAKTERIEN
.
24
3.2
2.1.2
ZELLAUFSCHLUSS
.
24
3.2.2
1.3
REINIGUNGSPROTOKOLL
.
25
3.2.2.2
AKTIVITAETSBESTIMMUNG
.
27
3.2.2
3
PROTEINNACHWEIS
MIT
DOT-BLOT
.
28
3.2.2.4
PROTEINBESTIMMUNG
.
29
3.2.2.5
PROTEINGELELEKTROPHORESE
.
29
3.2.25
1
SDS-PAGE
.
29
3.2.2.5.2
PROTEINGELELEKTROPHORESE
UNTER
NATIVEN
BEDINGUNGEN
.
29
3.2
2.6
KONTINUIERLICHE
MESSUNG
DER
HYDROLYSEAKTIVITAET
DER
6-PHOSPHO-SS-GALAKTOSIDASE
UND
IHRER
MUTANTEN
.
29
3.2.2.7
HEMMUNG
DER
6-PHOSPHO-SS-GALAKTOSIDASE-AKTIVITAET
DURCH
GALAKTURONAT
.
29
3.2
2.8HPLC
.
30
3.2.3
CHEMISCHE
METHODEN
.
30
3.2.3.1
SYNTHESE
VON
ORTHO-NITROPHENYL-SS-D-GALAKTOSE-6-PHOSPHAT
(ONPG-6-P)
.
30
3.2.3.2
NACHWEIS
VON
NACL
.
31
3.2.3.3
SYNTHESE
VON
ORTHO-NITROPHENYL-SS-D-GALAKTOSE-6-TOLUOLSULFONAT
(ONPG-6-TS)
.
31
3.2.3.4
SYNTHESE
VON
ORTHO-NITROPHENYL-SS-D-GALAKTOSE-6-METHYLSULFONAT
.
32
3.2.3.5
SYNTHESE
VON
ORTHO-NITROPHENYL-SS-D-GALAKTOSE-6-SUCCINAT
.
32
3.2.3.6
DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE
DER
SYNTHETISIERTEN
ZUCKER
.
33
3.2
3.7
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
DER
NITROPHENYLIERTEN
PRODUKTE
.
33
3.2
4
SPEKTROSKOPISCHE
METHODEN
.
33
3
2.4
1
NMR-UNTERSUCHUNGEN
.
33
3.2.4.2
ESI
.
34
3.2
4.3
MALDI
.
35
3.2.4.4
FLUORESZENZMESSUNGEN
.
36
4
ERGEBNISSE
.
38
4
1
MUTAGENESE
DER
6-PHOSPHO-SS-GALAKTOSIDASE
VON
LACTOCOCCUS
LACTIS
.
38
4.1.1
HERSTELLUNG
DER
MUTANTE
E160D/E375D
.
38
4.1
2
HERSTELLUNG
DER
MUTANTE
W429A
.
39
4.1
3
HERSTELLUNG
DER
MUTANTE
K435V/Y437F
.
39
4.1.4
HERSTELLUNG
DER
MUTANTE
S428D/K435V/Y437F
.
39
4.2
UEBEREXPRESSION
DER
6-PHOSPHO-SS-GALAKTOSIDASE
UND
DER
MUTANTENPROTEINE
.
40
4.3
CHARAKTERISIERUNG
DER
6-PHOSPHO-SS-GALAKTOSIDASE
UND
DER
MUTANTENPROTEINE
.
43
4.3.1
KINETISCHE
UNTERSUCHUNGEN
.
43
4.3.1.1
HYDROLYSE
VERSCHIEDENER
SUBSTRATE
DURCH
DIE
6-PHOSPHO-SS-GALAKTOSIDASE
(WILDTYP)
.
43
4.3.1.2
CHARAKTERISIERUNG
DER
MUTANTE
W429A
DER
6-PHOSPHO-SS-GALAKTOSIDASE
.
45
4.3.1.3
CHARAKTERISIERUNG
DER
MUTANTE
K435V/Y437F
DER
6-PHOSPHO-SS-GALAKTOSIDASE
.
46
4.3
1
4
CHARAKTERISIERUNG
DER
MUTANTEN
E160D/E375D
UND
S428D/K435V/Y437F
.
47
4
3.2
HEMMUNG
DER
6-PHOSPHO-SS-GALAKTOSIDASE
DURCH
GALAKTURONAT
.
47
4.3.3
FLUORESZENZUNTERSUCHUNGEN
.
49
4
4
CHEMISCHE
SYNTHESEN
.
56
4
4.1
SYNTHESE
VON
ONPG-6-TOSYLAT
.
57
4.4.2
SYNTHESE
VON
ONPG-6-MESYLAT
.
58
4.4.3
SYNTHESE
VON
ONPG-6-SUCCINAT
.
58
4.4.4
SPEKTROSKOPISCHE
UNTERSUCHUNG
VON
ONPG-6-TS
.
59
4.4
5
REAKTION
DER
GEBILDETEN
ONPG-DERIVATE
MIT
DER
6-PHOSPHO-SS-GALAKTOSIDASE
.
61
4
4.6
NMR
UNTERSUCHUNGEN
.
61
5
DISKUSSION
.
65
5.1
ERZEUGUNG
DER
MUTANTEN
.
65
5.1.1
MUTAGENESE
.
65
5
1.2
UEBEREXPRESSION
UND
REINIGUNG
.
66
5
2
CHARAKTERISIERUNG
DER
MUTANTEN
.
67
5.2.1
VERAENDERTES
KATALYTISCHES
VERHALTEN
DER
MUTANTEN
.
67
5.2.1.1
DIE
MUTANTE
E160D/E375D
.
67
5.2
1.2
DIE
MUTANTE
W429A
.
70
5.2.1.3
DIE
MUTANTE
K435V/Y437F
.
75
5.2
1
4
DIE
MUTANTE
S428/K435V/Y437F
.
78
5.2.2
FLUORESZENZMESSUNGEN
.
81
5.3
CHEMISCHE
SYNTHESEN
.
85
5.3
1
ANALYSE
DER
PRODUKTE
.
86
5.3.2
INTERAKTION
DER
6-PHOSPHO-SS-GALAKTOSIDASE
MIT
DEN
SYNTHETISIERTEN
KOHLENHYDRATEN
.
86
6
ZUSAMMENFASSUNG
.
90
7
LITERATURVERZEICHNIS
.
92 |
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| topic_facet | Aktives Zentrum Phosphogalactosidase 6-Phospho-beta-Galactosidase Punktmutation Lactococcus lactis Hochschulschrift |
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