Einfluß technologischer Verfahren auf die Nachweisbarkeit gentechnischer Veränderungen in Lebensmitteln mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion:
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München
Utz, Wiss.
2000
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| Schriftenreihe: | Lebensmitteltechnologie
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| adam_text | Titel: Einfluß technologischer Verfahren auf die Nachweisbarkeit gentechnischer Veränderungen in Lebensmi
Autor: Hupfer, Christine
Jahr: 2000
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung und Problemstellung......................._______.........................._..................„..................„...........I
2 Grundlagen...................................................................................................................„........................„......„ 4
2.1 Stand der Gentechnik im Agrar- und Lebensmittelsektor...........................................................................4
2.1.1 Anwendungsgebiete gentechnischer Verfahren..................................................................................4
2.1.2 Zulassung gentechnisch veränderter Organismen...............................................................................5
2.1.3 Kennzeichnung gentechnisch veränderter Lebensmittel......................................................................7
2.2 Nachweismethoden für gentechnisch veränderte Lebensmittel...................................................................9
2.2.1 Einleitung............................................................................................................................................9
2.2.2 Phänotypischer Nachweis.................................................................................................._.................9
2.2.3 Nachweis neuer StofTwechselprodukte.............................................................................................10
2.2.3.1 Inhaltsstoffe................................................................................................................................10
2.2.3.2 Neu exprimierte Proteine............................................................................................................10
2.2.4 Genotypischer Nachweis...................................................................................................................11
2.3 Entwicklung von Nachweissystemen auf DNA-Ebene..............................................................................13
2.3.1 Prinzip der Polymerasekettenreaktion (PCR)....................................................................................13
2.3.2 Entwicklung von Primcrsystemen.....................................................................................................15
2.3.2.1 Wahl der Zielsequenz.................................................................................................................15
2.3.2.2 Wahl der Primer.........................................................................................................................15
2.3.3 Gesamtkonzept des Nachweises........................................................................................................16
2.3.3.1 DNA-Extraktion.........................................................................................................................16
2.3.3.2 PCR-Nachweis...........................................................................................................................16
2.3.3.3 Verifizierung...............................................................................................................................17
2.3.4 Aussagekraft einer PCR-Analyse......................................................................................................18
2.4 Quantitative PCR......................................................................................................................................19
2.4.1 Einsatz in der Lebensmittelanalytik............................................................................................-.....19
2.4.2 Quantifizierung mittels externem Standard.......................................................................................19
2.4.3 Quantifizierung mittels internem Standard........................................................................................20
2.4.3.1 Prinzip der competitiven PCR....................................................................................................20
2.4.3.2 Einfach competitive PCR...........................................................................................................22
2.4.3.3 Doppelt competitive PCR...........................................................................................................22
2.4.4 Rcal-TimePCR.................................................................................................................................23
2.5 Untersuchte gentechnisch veränderte Organismen....................................................................................24
2.5.1 Bt-Mais (Event 176)..........................................................................................................................24
2.5.2 B33-INV Kartoffel (Invertase-KanoiTel)..........................................................................................26
2.5.3 Roundup Ready-Soja.........................................................................................................................27
3 Material und Metfcoden..______»»_.„__._________-____________—...____________________28
3.1 Material.....................................................................................................................................................28
3.1.1 Pflanzliche Rohstoffe........................................................................................................................28
3.1.1.1 Mais............................................................................................................................................28
3.1.1.2 Kartoffeln...................................................................................................................................28
3.1.1.3 Soja.............................................................................................................................................28
3.1.2 Kommerzielle Mais-. Soja-und Kartoffclprodukte...........................................................................29
3.1.2.1 Maisprodutte..............................................................................................................................29
3.1.2.2 Sojaprodukte...........................................................................................................-...................29
3.1.2.3 Kartoflclprodukte.......................................................................................................................29
3.1.3 DNA-Sequenzen und Konstrukte......................................................................................................30
3.1.4 Chemikalien......................................................................................................................................3!
3.1.5 Primer...............................................................................................................................................31
3.1.6 llybridisterungssondcn......................................................................................................................32
3.1.7 Polymerasc........................................................................................................................................32
3.1.8 DNA-Gröflenstandards......................................................................................................................32
3.1.9 GerMe................................................................................................................................................33
3.1.10 Software............................................................................................................................................33
Inhaltsverzeichnis
3.2 Methoden..................................................................................................................................................34
3.2.1 DNA-Extraktion................................................................................................................................34
3.2.1.1 Allgemeines................................................................................................................................34
3.2.1.2 Phenol/Chloroform-Extraktion (42]...........................................................................................34
3.2.1.3 CTAB-Extraktion [68]................................................................................................................35
3.2.1.4 CTAB-Fällung [72]....................................................................................................................35
3.2.1.5 Festphasenextraktion..................................................................................................................35
3.2.2 DNA-Konzemrationsbestimmung.....................................................................................................36
3.2.3 Agarosegelelektrophorese.................................................................................................................37
3.2.4 Polymerasekettenreaktion.................................................................................................................37
3.2.5 Southern Blot und Sondenhybridisierung..........................................................................................39
3.2.5.1 Kapillarblot von PCR-Produkten................................................................................................39
3.2.5.2 Sondenhybridisierung.................................................................................................................39
3.2.5.3 Immunologische Detektion.........................................................................................................40
3.2.6 Herstellung von Polenta....................................................................................................................40
3.2.7 Studien zur PCR-Inhibition...............................................................................................................41
3.2.7.1 Herstellung der Maisprodukte....................................................................................................41
3.2.7.2 Herstellung der DNA-Extrakte...................................................................................................41
3.2.7.3 Herstellung der Inhibitorlösungen..............................................................................................41
3.2.7.4 Untersuchung des (-)-Epicatechingehaltes mittels HPLC...........................................................42
3.2.8 Untersuchung von Silage aus Bt-Mais..............................................................................................43
3.2.8.1 Nicht silierte Maisganzpflanzen.................................................................................................43
3.2.8.2 Schlauchsilage............................................................................................................................43
3.2.8.3 Silage im Labormaßstab.............................................................................................................44
3.2.9 Untersuchung des Brennprozesses....................................................................................................44
3.2.9.1 Herstellung thermisch behandelter Kartoflelproben....................................................................44
3.2.9.2 Kontinuierliches DSA-Verfahren...............................................................................................45
3.2.9.3 Diskontinuierliches DSA-Verfahren...........................................................................................46
3.2.9.4 Dämpfverfahren..........................................................................................................................47
3.2.9.5 Alkoholgewinnung im Labormaßstab........................................................................................47
3.2.9.6 Probenaufarbeitung.....................................................................................................................48
3.2.10 Untersuchung von Backwaren...........................................................................................................48
3.2.10.1 Rohstoffe....................................................................................................................................48
3.2.10.2 Mehrkornbrote............................................................................................................................49
3.2.10.3 Feinbackware..............................................................................................................................50
3.2.10.4 Toastbrot.....................................................................................................................................50
3.2.11 Quantitative competitive PCR...........................................................................................................51
3.2.11.1 Herstellung der Competitor-Plasmide........................................................................................51
3.2.11.2 Allgemeine Probenvorbereitung.................................................................................................52
3.2.11.3 Competitive PCR........................................................................................................................52
3.2. II.4 Berechnung von Äquivalenzpunkt und Bt-Anteil........................................................................53
3.2.11.5 Quantitative Bestimmung des Bt-Anteils in hitzebehandeiten Proben........................................54
4 Ergebnisse imd Diskussion...................................__..................................................................................... 56
4.1 Etablicrung von Nachweissystemen für Bt-Mais......................................................................................56
4.1.1 Einleitung..........................................................................................................................................56
4.1.2 Nachweis des Strukturgens cry/.4rt ;..................................................................................................56
4.1.2.1 DNA-Extraktion............. ............................................................................................................56
4.1.2.2 Wahl von Zielsequenz. Primern und Sonde.................................................................................57
4.1.2.3 PCR-Nachweis und Verifizierung..............................................................................................58
4.1.2.4 Sensitivität..................................................................................................................................60
4.1.3 Nachweis eines Übergangsbereiches.................................................................................................63
4.1.3.1 Wahl von Zietsequcnz. Primern und Sonde.................................................................................63
4.1.3.2 PCR-Nachweis und Verifizierung..............................................................................................64
4.1.3.3 Sensitivita..................................................................................................................................65
4.1.4 Zusammenfassung.............................................................................................................................68
Inhaltsverzeichnis III
4.2 Modellversuche zum Einfluß von I Fitze und pH-Wert auf den Nachweis.................................................70
4.2.1 Einleitung..........................................................................................................................................70
4.2.2 Einlluß von Hit2e..............................................................................................................................70
4.2.3 Einfluß des pH-Wertes......................................................................................................................74
4.2.4 Zusammenfassung.............................................................................................................................76
4.3 Untersuchung handelsüblicher Produkte...................................................................................................77
4.3.1 Einleitung..........................................................................................................................................77
4.3.2 Untersuchung von Maisprodukten....................................................................................................77
4.3.3 Sojaproduktc.....................................................................................................................................83
4.3.4 Kartoffelproduktc..............................................................................................................................85
4.3.5 Zusammenfassung.............................................................................................................................86
4.4 Inhibition der PCR durch Lcbensmittclinhallsstoft c.................................................................................88
4.4.1 Einleitung..........................................................................................................................................88
4.4.2 Inhibition durch Schokolade und Kakaopulver.................................................................................89
4.4.2.1 Inhibitorischc Wirkung von Schokoladenübcrzugcn und Kakaopulver......................................89
4.4.2.2 Inhibition bei direkter Zugabc der Zutat zur PCR.......................................................................91
4.4.2.3 Inhibition bei Zugabc des Extraktes aus einer Zulai zur PCR.....................................................92
4.4.3 Inhibition durch Einzcisubstanzcn....................................................................................................94
4.4.3.1 Thcobromin und ColTcin............................................................................................................94
4.4.3.2 (-)-Epicatcchin............................................................................................................................95
4.4.3.3 Verhallen von (-)-Epicatcchin im Verlauf der Phenol/Chloroform-Extraktion...........................97
4.4.4 Zusammenfassung.............................................................................................................................98
4.5 Einfluß des Silierprozesses auf den Nachweis von Bt-Mais.....................................................................99
4.5.1 Einleitung..........................................................................................................................................99
4.5.2 Vergleich von frischem und siliertem Mais......................................................................................99
4.5.3 Untersuchung von Silage im Labormaßstab....................................................................................103
4.5.4 Untersuchung der Schlauchsilagc....................................................................................................104
4.5.5 Zusammenfassung..........................................................................................................-................106
4.6 Nachweisbarkeit von DNA im Verlauf des Brennprozesses....................................................................107
4.6.1 Einleitung........................................................................................................................................107
4.6.2 Kartoftclbrcnncrer...........................................................................................................................108
4.6.2.1 Entwicklung geeigneter PCR-Systemc......................................................................................108
4.6.2.2 Modellversuch zum llitzecinlluß.............................................................................................112
4.6.2.3 Brennprozeß nach dem kontinuierlichen DSA-Verfahren.........................................................114
4.6.2.4 Brennprozeß nach dem diskontinuierlichen DSA-Verfahren....................................................117
4.6.2.5 Brennprozeß im Labormaßstab.................................................................................................118
4.6.3 Maisbrenncrei..................................................................................................................................122
4.6.3.1 Brennprozeß nach dem Dämpfverfahren...................................................................................123
4.6.3.2 Brennprozeß im LabormaGstab............................................................................................— 125
4.6.4 Zusammenfassung...........................................................................................................................128
4.7 Nachweis gentechnisch veränderter Zutaten in Backwaren.....................................................................130
4.7.1 Einleitung...............................................................................................................-........................130
4.7.2 Einflußfaktorcn auf die DNA im Zuge des Backprozesses..............................................................131
4.7.3 Mchrkornbrot..................................................................................................................................132
4.7.4 Feinbackware..................................................................................................................................137
4.7.5 Toastbrot mit gcntcchnisch veränderter Sojazutal...........................................................................140
4.7.6 Zusammenfassung...........................................................................................................................144
IV Inhaltsverzeichnis
4.8 Quantifizierung von DNA aus gentechnisch veränderten Organismen....................................................146
4.8.1 Einleitung........................................................................................................................................146
4.8.2 Herstellung der Competitor-Plasmide.............................................................................................146
4.8.3 Quantifizierung des Bt-Anteils in DNA-Mischungen mittels einfach competitiver PCR................148
4.8.4 Quantifizierung des Bt-Anteils in Maismehlmischungen mittels einfach competitiver PCR...........150
4.8.5 Quantifizierung von DNA in hitzebehandelten Proben....................................................................151
4.8.5.1 Quantifizierung des Bt-Anteils in Polenta mittels einfach competitiver PCR...........................151
4.8.5.2 Quantifizierung des Bt-Anteils in DNA-Mischungen im Verlauf einer Hitzebehandlung
mittels einfach competitiver PCR..............................................................................................153
4.8.5.3 Quantifizierung des Bt-Anteils in DNA-Mischungen im Verlauf einer Hitzebehandlung
mittels doppelt competitiver PCR..............................................................................................155
4.8.6 Zusammenfassung...........................................................................................................................157
5 Zusammenfassung.......... 158
6 Literaturverzeichnis__________________________161
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