Nachweis des BHV-1 im Blut natürlich infizierter Rinder mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) und Differenzierung zwischen Feldvirus und gE-negativem Impfvirus:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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1999
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1
EINLEITUNG
.
8
1.1
TAXONOMIE
.
8
1.2
PATHOGENESE,
KLINIK
.
9
1J
EPIDEMIOLOGIE
.
11
1.4
GENOMORGANISATION
.
12
1.S
IMMUNOLOGIE.
13
1.6
BEKAEMPFUNG
.
IS
1.7
DIAGNOSE.
.
17
1.8
ZIELSETZUNG
.
19
2
MATERIALIEN
.
21
2.1
VIRUSSTAEMME
UND
ZELLEN.
.
21
2.1.1
VIRUSSTAEMME
.
21
2.1.2
ZELLEN
.
21
2.2
REAGENTIEN
.
21
2.3
NUKLEINSAEUREN
UND
NUKLEOTIDE
.
23
2.4
ENZYME
.
23
2.5
KITS
.
23
2.6
GERAETE
UND
LABORHILFSMITTEL
.
24
2.7
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
26
MEDIEN
UND
LOESUNGEN
FUER
DIE
ZELLKULTUR
.
26
LOESUNGEN
FUER
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
.
27
LOESUNGEN
FUER
DNA-HYBRIDISIERUNG
.
28
PUFFER
UND
LOESUNGEN
ZUR
DNA-PRAEPARATION
AUS
BLUT
.
29
LOESUNGEN
ZUR
AUFARBEITUNG
SYNTHETISCHER
OLIGONUKLEOTIDE
.
31
LOESUNGEN
ZUR
POLYMERASEKETTENREAKTION
.
31
MEDIEN FUER BAKTERIENKULTUR
.
32
LOESUNGEN
ZUR
PLASMID
UND
VIRUS-DNA-PRAEPARATION
.
34
PUFFER
UND
LOESUNGEN
FUER
SEQUENZIERUNGEN
.
35
3
METHODEN
.
3.1
ZELLKULTUR
.
36
3.2
VIRUSVERMEHRUNG.
.
36
3.3
VIRUSTITRATION
.
37
3.4
ISOLIERUNG
VIRALER
DNA
.
37
3.4.1
PHENOLEXTRAKTION
.
38
3.4.2
ETHANOLFAELLUNG
.
38
3.5
DNA-SPALTUNG
MIT
RESTR1KTIONSENDONUKLEASEN
.
39
3.6
AGAROSEGELEKTROPHORESE
.
39
3.7
DNA-HYBRIDISIERUNG.
.
40
3.7.1
SOUTHEM-BLOT-TRANSFER
.
40
3.7.2
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
LMT-AGAROSEGELEN
.
40
3.7.3
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA-SONDEN
.
41
3.7.4
ABTRENNUNG
NICHT
EINGEBAUTER
RADIONUKLEOTIDE
.
41
3.7.5
SOUTHEM-BLOTHYBRIDISIERUNG
.
42
3.7.6
AUTORADIOGRAPHIE
.
43
3.7.7
REHYBRIDISIERUNG
DER
NYLONMEMBRAN
.
43
3.8
METHODEN
ZUR
DNA-PRAEPARATION
AUS
BLUT
.
43
3.8.1
GUANIDINIUM-HCL-EXTRAKTION
.
43
3.8.2
PUREGENETM
DNA-ISOLIERUNGSKIT
.
44
3.9
PHOTOMETRISCHE
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN.
45
3.10
AUFARBEITUNG
SYNTHETISCHER
OLIGONUKLEOTIDPRIMER
_
45
3.11
BERECHNUNG
DER
SCHMELZTEMPERATUR
DER
OL1GONUKLEOTIDE
_
46
3.12
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
_
47
3.13
KLONIERUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
.
48
3.13.1
LIGATION
.
49
3.13.2
TRANSFORMATION
.
49
3.13.3
SCHNELLPRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
.
49
3.13.4
DNA-RESTRIKTIONSSPALTUNG
.
50
3.13.5
LAGERUNG
VON
BAKTERIEN
.
50
3.14
DNA-DOPPELSTRANG-SEQUENZIERUNG.
.
51
3.14.1
SEQUENZREAKTION
.
51
3.14.2
SEQUENZGELE
.
52
3.15
NACHWEIS
VON
SERUMANTIKOERPERN
.
53
3.15.1
CHEKIT-TRACHITEST
.
53
3.15.2
SERELISA
.
54
3.16
PCR-ELISA
.
55
3.17
TIERVERSUCH
.
56
3.17.1
IMPFUNG
MIT
BAYOVACSMARKER
(LEBEND)
.
56
3.17.2
PROBENENTNAHME
UND
AUFARBEITUNG
.
56
3.17.2.1
BLUTPROBEN
.
56
3.17.2.2
SERUMGEWINNUNG
.
57
5
4
ERGEBNISSE
.
58
4.1
ETABLIERUNG
VERSCHIEDENER
PCR-TESTS
ZUM
NACHWEIS
DES
BHV-1
.
58
4.1.1
AUSWAHL
DER
PRIMER
.
58
4.1.2
KONTROLL-PCR
.
60
4.1.3
OPTIMIERUNG
DER
PCR-BEDINGUNGEN
.
60
4.1.4
MULTIPLEX-PCR
.
63
4.1.5
SPEZIFITAET
.
66
4.1.6
NEST-PCR
.
68
4.1.7
SENSITIVITAET
.
69
4.2
DNA-ANALYSEN
.
74
4.2.1
SPALTMUSTER
.
74
4.2.2
SOUTHEM-BLOTHYBRIDISIERUNG
DER
RESTRIKTIONSSPALTUNGEN
.
76
4.2.3
DNA-SEQUENZANALYSE
DER
PCR-PRODUKTE
.
78
4.2.4
VERGLEICH
MIT
DATEN
AUS
DER
GENBANK
.
80
4.3
NACHWEIS
DES
BHV-1
IM
BLUT
INFIZIERTER
RINDER
.
84
4.3.1
DNA-PRAEPARATION
DER
BLUTZELL-DNA
.
84
4.3.2
SENSITIVITAET
.
84
4.3.3
SPEZIFITAET
.
87
4.4
BESTANDSUNTERSUCHUNGEN
.
88
4.4.1
AUSWAHL
DER
BESTAENDE
.
88
4.4.2
UNTERSUCHUNGSERGEBNISSE
DES
BESTANDES
EC
.
88
4.4.3
UNTERSUCHUNGSERGEBNISSE
DES
BESTANDES
BE
.
89
4.4.4
UNTERSUCHUNGSERGEBNISSE
DES
BESTANDES
BO
.
91
4.4.5
UNTERSUCHUNGSERGEBNISSE
DES
BESTANDES
BR
.
95
4.4.6
UNTERSUCHUNGSERGEBNISSE
DES
BESTANDES
FO
.
97
4.4.7
NEST-PCR
.
99
4.4.8
SOUTHEM-BLOTHYBRIDISIERUNG
.
100
4.5
PCR-ELISA
ZUM
NACHWEIS
DES
BHV-1
.
105
4.5.1
WAHL
DER
FANGSONDEN
.
105
4.5.2
ELISA-OPTIMIERUNG
.
105
4.5.3
SENSITIVITAET
.
106
4.5.4
BESTANDSUNTERSUCHUNGEN
.
109
4.6
TIERVERSUCH
.
113
5.
DISKUSSION
.
LLFI
5.1
SENSITIVITAETSVERGLEICH
DER
PCR-VERFAHREN
.
116
5.2
SPEZIFITAETSTESTS.
.
117
6
S.3
DNA-ANALYSEN
.
118
5.4
NACHWEIS
DES
BHV-1
IM
BLUT
.
119
5.5
VIRAEMIE
NACH
BHV-1
INFEKTION.
.
120
5.6
BESTANDSUNTERSUCHUNGEN
.
121
5.7
PCR-ELISA
.
126
6,
ZUSAMMENFASSUNG
.
IM
7,
SUMMARY
.
.
.
130
8.
VERZEICHNIS
DER
ABKUERZUNGEN
.
IXUIXIUSUXMUUXIUUMXTXTTSUTUMIUUIUSXXUUXU
122
9.
LITERATURVERZEICHNIS.
.
135
7 |
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