Klonierung, Expression, Reinigung, biochemische Charakterisierung und Röntgenstrukturanalyse des Proteasekomplexes der ATP-abhängigen Protease Heat shock locus VU (HslVU) aus E. coli:
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1999
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INHALTSVERZEICHNIS
1
ZUSAMMENFASSUNG
1
2
EINLEITUNG
3
2.1
PROTEINABBAU
IN
EUKARYONTEN:
DER
UBIQUITIN-PROTEASOM-WEG
3
2.2
PROTEINABBAU
IN
PROKARYONTEN:
DIE
ATP-ABHAENGIGEN
PROTEASEN
4
2.2.1
LON
(LA)
5
2.2.2
CLPAP
(TI)
5
2.2.3
CLPXP
6
2.2.4
FTSH
(HAB)
6
2.2.5
HSLVU
(CLPQY)
7
3
MATERIALIEN
UND
GERAETE
9
3.1
OLIGONUKLEOTIDE
9
3.1.1
OLIGONUKLEOTIDE
FUER
DIE
SEQUENZIERUNG
9
3.1.2
OLIGONUKLEOTIDE
FUER
DIE
EXPRESSION
IN
E.
COLI
10
3.1.3
OLIGONUKLEOTIDE
FUER
DIE
EXPRESSION
IN
B.
SUBTILIS
10
3.1.4
OLIGONUKLEOTIDE
FUER
DIE
TWO-HYBRID
EXPERIMENTE
11
3.2
PLASMIDE
11
3.3
BAKTERIEN
11
3.4
HEFEN
12
3.5
ENZYME
12
3.6
KITS
12
3.7
CHEMIKALIEN
13
3.8
SAEULENMATERIALIEN
13
INHALTSVERZEICHNIS
3.9
GERAETE
14
4
METHODEN
16
4.1
ARBEITEN
MIT
DNA
16
4.1.1
PCR
AUF
GENOMISCHER
DNA
UND
AUF
GANZEN
ZELLEN
16
4.1.2
REINIGUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
16
4.1.3
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
16
4.1.4
EXTRAKTION
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
17
4.1.5
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
AUS
E.
COLI
(PHENOL-CHLOROFORM)
17
4.1.6
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
AUS
E.
COLI
(MIT
SPINPREPSAEULEN)
18
4.1.7
BESTIMMUNG
DER
DNA-KONZENTRATION
18
4.1.8
SEQUENZIERUNG
GEREINIGTER
PLASMID-DNA
18
4.2
ARBEITEN
MIT
BAKTERIEN
19
4.2.1
FLUESSIGKULTUREN
19
4.2.2
PLATTENKULTUREN
20
4.2.3
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
E.
COLI
20
4.2.4
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
E.
COLI
21
4.2.5
EXPRESSION
REKOMBINANTER
GENE
IN
E.
COLI
21
4.2.6
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
B.
SUBTILIS
22
4.2.7
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
B.
SUBTILIS
22
4.2.8
EXPRESSION
REKOMBINANTER
GENE
IN
B.
SUBTILIS
22
4.3
ARBEITEN
MIT
PROTEINEN
23
4.3.1
GELELEKTROPHORESE
23
4.3.2
BLOTTING
25
4.3.3
PROTEINFAERBUNG
25
4.3.4
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
26
4.3.5
AKTIVITAETSTESTS
28
4.4
TWO-HYBRID-SYSTEM
29
4.4.1
MEDIEN,
KULTURPLATTEN
30
4.4.2
AMPLIFIKATION
EINER
GENBANK
IN
E.
COLI
31
4.4.3
TRANSFORMATION
IN
HEFEN
32
4.4.4
INTERAKTIONSTEST
MIT
AT-PLATTEN
33
INHALTSVERZEICHNIS
4.4.5
INTERAKTIONSTEST
MIT
SS-GAL-ASSAY
33
4.4.6
DNA-ISOLATION
AUS
HEFEN
33
4.4.7
TRENNUNG
VON
BAIT
UND
PREY
34
5
ERGEBNISSE
35
5.1
KLONIERUNG
UND
EXPRESSION
35
5.1.1
HSLVU
AUS
E.
COLI
IN
E.
COLI
36
5.1.2
HSLU
AUS
L.
LEICHMANNII
IN
E.
COLI
37
5.1.3
HSLVU
AUS
A.
AEOLICUS
IN
E.
COLI
38
5.1.4
HSLU
AUS
B.
SUBTILIS
IN
B.
SUBTILIS
39
5.1.5
DIE
TWO-HYBRID-KONSTRUKTE
40
5.2
PROTEINREINIGUNG
42
5.2.1
HSLV
AUS
E.
COLI
OHNE
AFFINITAETSTAG
42
5.2.2
HSLV
AUS
E.
COLI
MIT
AFFINITAETSTAG
44
5.2.3
HSLU
AUS
E.
COLI
OHNE
AFFINITAETSTAG
45
5.2.4
HSLU
AUS
E.
COLI
MIT
AFFINITAETSTAG
47
5.2.5
HSLU
AUS
A.
AEOLICUS
OHNE
AFFINITAETSTAG
48
5.3
BIOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
51
5.3.1
DIE
AKTIVITAET
GEGEN
KLEINE
CHROMOGENE
SUBSTRATE
51
5.3.2
DIE
AKTIVITAET
GEGEN
DENATURIERTE
PROTEINSUBSTRATE
52
5.3.3
SYNTHETISCHE
AKTIVATOREN
FUER
HSLV
52
5.4
KRISTALLISATION
54
5.4.1
HSLV
AUS
E.
COLI
54
5.4.2
HSLU
AUS
E.
COLI
55
5.4.3
HSLVU
AUS
E.
COLI
56
5.5
STRUKTURAUFKLAERUNG
VON
HSLV
58
5.5.1
DIE
BESTIMMUNG
DER
RAUMGRUPPE
58
5.5.2
DIE
POSITION
DES
OLIGOMERS
IM
KRISTALL
59
5.5.3
DIE
SUCHE
NACH
SCHWERATOMDERIVATEN
62
5.6
DAS
MODELL
70
INHALTSVERZEICHNIS
6
DISKUSSION
76
6.1
KLONIERUNG,
EXPRESSION,
REINIGUNG
76
6.2
STRUKTURANALYSE
HSLV
77
6.3
STRUKTURBESCHREIBUNG
HSLV
77
6.4
DIE
AKTIVIERUNG
VON
HSLV
DURCH
HSLU
79
6.4.1
PEPTIDASEAKTIVITAET
79
6.4.2
PROTEASEAKTIVITAET
80
6.5
DIE
AKTIVIERUNG
VON
HSLV
DURCH
SYNTHETISCHE
AKTIVATOREN
80
6.6
DER
AKTIVIEMNGSMECHANISMUS
82
6.7
EINE
EIGENSTAENDIGE
ROLLE
VON
HSLU
ALS
CHAPERON?
83
6.8
EIN
YYUBIQUITINWEG
"
IN
BAKTERIEN?
83
7
LITERATURVERZEICHNIS
85 |
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