Genetische Analysen als Beitrag zum Verständnis der Spaltöffnungsbewegung in Arabidopsis thaliana:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1999
|
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Enth.: 1. Auxininduzierte Genexpression in Schließzellen. - 2. Isolierung und Charakterisierung der für mutmaßliche Ionentransporter kodierenden Gene AtCNBT1 und AtCNBT2. - Köln, Univ., Diss., 1999 |
| Beschreibung: | VIII, 187 S. Ill., graph. Darst. |
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
.
1
1.1
BAU
UND
FUNKTION
DER
STOMATA
.
1
1.1.1
LONENSTROEME
DURCH
DIE
PLASMAMEMBRAN
.
3
1.1.2
LONENSTROEME
DER
VAKUOLE
.
5
1.1.3
KANALPROTEINE
IN
SCHLIESSZELLEN
.
5
1.1.3.1
EINWAERTSREKTIFIZIERENDE
KALIUMKANAELE
DER
PLASMAMEMBRAN
.
5
1.1.3.2
AUSWAERTSREKTIFIZIERENDE
KALIUMKANAELE
DER
PLASMAMEMBRAN
.
6
1.1.4
SIGNALUEBERTRAGUNG
IN
SCHLIESSZELLEN
.
7
1
2.
DER
EINFLUSS
VON
AUXIN
AUF
DIE
SCHLIESSZELLENBEWEGUNG
.
8
1.3
ANSAETZE
ZUR
ANALYSE
DIFFERENZLELLER
GENEXPRESSION
.
11
1.3.1
DIE
CDNA-AFLP
ANALYSE
.
12
1.3.2
DIECDNA-RDA
.
14
1.4
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
.
16
2
MATERIAL
.
17
2.1
PFLANZEN
.
17
2.2
BAKTERIEN
.
17
2.2.1
ESCHERICHIA
COLI
.
17
2.2.2
AGROBACTERIUM
TUMEFACIENS.
.
17
2.3
GENOMLSCHE
UND
CDNA-BIBLLOTHEKEN
.
17
2.4
PLASMIDE
UND
VEKTOREN
.
17
2.5
SYNTHETISCHE
OLIGONUKLEOTIDE
.
18
2.5.1
ALLGEMEINE
OLIGONUKLEOTIDE
.
18
2.5.2
OLIGONUKLEOTIDE
FUER
DIE
CDNA-AFLP
ANALYSE
.
19
2.5.2.1
ADAPTER,
OO-PRIMER
UND
+2-PRIMER
.
19
2.5.2.2
+3-PRIMER
UND
+4-PRIMER
.
20
2.5.3
OLIGONUKLEOTIDE
FUER
DIE
CDNA-RDA
.
22
2.6
ENZYME
.
22
2.7
CHEMIKALIEN
.
23
2.8
GERAETE
.
24
2.9
VERBRAUCHSMATERIALIEN
.
25
INHALTSVERZEICHNIS
2.10
ELEKTRONISCHE
DATENVERARBEITUNG
.
26
2.10.1
HARDWARE
.
26
2.10.2
SOFTWARE
.
26
2.11
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
27
2.11.1
ALLGEMEINE
LOESUNGEN
.
27
2.11.2
KULTURMEDIEN
.
28
2.11.3
STAMMLOESUNGEN
FUER
ANTIBIOTIKA,
HONNONE
UND
VITAMINE
.
29
3
METHODEN
.
31
3.1
ALLGEMEINE
MOLEKULARBIOLOGLSCHE
TECHNIKEN
.
31
3.1.1
KLONIERUNG
UND
ANALYSE
VON
DNA
.
31
3.1.1.1
ENDONUKLEOLYTISCHE
SPALTUNGEN
.
31
3.1.1.2
MODIFIZIERUNG
VON
DNA-ENDEN
.
31
3.1.1.3
ELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
IN
AGAROSEGELEN
.
31
3.1.2
PCR
.
32
3.2
TECHNIKEN
ZUM
ARBEITEN
MIT
ESCHERICHIA
COLI
_
32
3.2.1
PRAEPARATION
KOMPETENTER
E.
COLI
ZELLEN
ZUR
ELEKTROTRANSFORMATION
.
32
3.2.2
ELEKTROTRANSFORMATION
VON
PLASMID
DNA
IN
E.
COLI
.
32
3.2.3
PRAEPARATION
VON
PLASMID
DNA
AUS
E.
COLI
.
33
3.3
ALLGEMEINE
METHODEN
DER
PFLANZENKULTIVIERUNG
.
33
3.4
HERSTELLUNG
TRANSGENER
PFLANZEN
.
33
3.4.1
VORBEREITUNG
DER
AGROBACTERIUM
TUMEFACIENS
ZELLEN
.
33
3.4.1.1
PRAEPARATION
KOMPETENTER
AGROBACTERIUM
TUMEFACIENS
ZELLEN
ZUR
ELEKTROTRANSFORMATION
.
33
3.4.1.2
ELEKTROTRANSFONNATION
VON
PLASMID
DNA
IN
A.
TUMEFACIENS
.
34
3.4.1.3
PRAEPARATION
VON
PLASMID
DNA
AUS
A.
TUMEFACIENS
.
34
3.4.2
VAKUUMTRANSFONNATION
VON
ARABIDOPSIS
THALIANA
.
34
3.4.3
OBERFLAECHENSTERILISIERUNG
VON
ARABIDOPSIS
THALIANA
SAMEN
.
34
3.4.4
SELEKTION
HOMOZYGOTER
PFLANZENLINIEN
.
34
3.5
ISOLIERUNG
VON
SCHLIESSZELLEN
AUS
ARABIDOPSIS
THALIANA
BLAETTERN
.
35
3.5.1
VITALFAERBUNG
VON
EPIDERMISSTREIF
EN
.
35
3.6
ISOLIERUNG
VON
RNA
AUS
PFLANZENGEWEBE
.
35
3.7
ISOLIERUNG
GENOMLSCHER
DNA
AUS
PFLANZEN
.
36
3.7.1
MINI-PRAEPARATION
.
36
3.7.2
MIDI-PRAEPARATION
.
36
INHALTSVERZEICHNIS
3.8
ISOLIERUNG
GENOMLSCHER
DNA
AUS
HEFE
.
36
3.9
ISOLIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
VON
BAC
DNA
.
37
3.10
TRANSFER
VON
NUKLEINSAEUREN
AUS
AGAROSEGELEN
AUF
NYLONMEMBRANEN
.
37
3.10.1
SOUTHERN
BLOT
.
37
3.10.2
NORTHERN
BLOT
.
37
3.11
HYBRIDISIERUNG
MEMBRANGEBUNDENER
NUKLEINSAEUREN
MIT
DNA-SONDEN
.
37
3.11.1
HYBRIDISIERUNG
VON
DNA
.
37
3.11.1.1
SOUTHERN
BLOTS
UND
CDNA-BIBLIOTHEK
FILTER
.
37
3.11.1.2
REDUZIERTE
STRINGENZ
.
37
3.11.1.3
BAC-BIBLIOTHEK
FILTER
.
38
3.11.1.4
YAC-BIBLIOTHEK
FILTER
.
38
3.11.2
HYBRIDISIERUNG
VON
RNA
.
38
3.11.3
MARKIERUNG
VON
DNA-SONDEN
MIT
RADIOAKTIVEN
NUKLEOTIDEN
.
38
3.12
QUALITATIVE
RT-PCR
.
38
3.12.1
RNA-PRAEPARATION
.
38
3.12.2
CDNA-SYNTHESE
.
38
3.12.3
PCR
.
39
3.13
INVERSE
PCR
.
39
3.14
TRANSIENTE
EXPRESSION
VON
GFP-FUSLONSPROTEINEN
IN
TABAKPROTOPLASTEN
.
40
3.15
ANFERTIGEN
VON
GEWEBESCHNITTEN
.
40
3.15.1
FIXIERUNG
DER
GEWEBEPROBEN
.
40
3.15.2
EINBETTEN
DER
GEWEBEPROBEN
UND
ANFERTIGEN
DER
SCHNITTE
.
40
3.16
QUALITATIVER
NACHWEIS
VON
GUS-AKTIVITAET
IN
TRANSGENEN
PFLANZEN
.
41
3.17
ANALYSE
DLFFERENZIELLER
GENEXPRESSION
IN
SCHLIESSZELLEN
.
41
3.17.1
BEHANDLUNG
DER
SCHLIESSZELLEN
MIT
PHYTOHONNONEN
.
41
3.17.2
CDNA-AFLP
ANALYSE
.
41
3.17.2.1
ISOLIERUNG
VON
POLY(A+)
RNA
.
41
3.17.2.2
CDNA-SYNTHESE
.
41
3.17.2.3
HERSTELLUNG
DES
ERSTEN
TEMPLATES
.
41
3.17.2.4
PRAEAMPLIFIKATION
-
HERSTELLUNG
DES
ZWEITEN
TEMPLATES
.
42
3.17.2.5
MARKIERUNG
EINES
SELEKTIVEN
E+2-PRIMERS
MIT
"
P
.
42
3.17.2.6
SELEKTIVE
PCR
.
42
3.17.2.7
ANALYSE
DER
CDNA-AFLP
PCR-PRODUKTE
.
42
3.17.2.8
ISOLIERUNG
VON
TDFS
AUS
DEM
CDNA-AFLP
GEL
.
43
INHALTSVERZEICHNIS
3.17.3
DIECDNA-RDA
.
43
3.17.3.1
ISOLIERUNG
DER
RNA
AUS
DEN
SCHLIESSZELLEN
UND
CDNA-SYNTHESE
.
43
3.17.3.1.1
ISOLIERUNG
VON
RNA(1.)
.
43
3.17.3.1.2
CDNA-SYNTHESE
(1.)
.
43
3.17.3.1.3
ISOLIERUNG
VON
RNA
(2.)
.
44
3.17.3.1.4
CDNA-SYNTHESE
(2.)
.
44
3.17.3.2
BESTIMMUNG
DER
AUSBEUTE
NACH
DER
CDNA-SYNTHESE
.
44
3.17.3.3
VORBEREITUNG
DER
CDNA
FUER
DIE
HERSTELLUNG
DER
REPRAESENTATIONEN
.
44
3.17.3.4
HERSTELLUNG
DER
CDNA-REPRAESENTATIONEN
FUER
DIE
TESTER-PROBEN
.
44
3.17.3.5
HERSTELLUNG
DER
CDNA-REPRAESENTATIONEN
FUER
DIE
DRIVER-PROBEN
.
45
3.17.3.6
HERSTELLUNG
DES
DRIVERS
.
45
3.17.3.7
HERSTELLUNG
DES
TESTERS
.
45
3.17.3.8
ERSTE
SUBTRAKTIVE
HYBRIDISIERUNG
.
45
3.17.3.9
AMPLIFIKATION
DER
TESTER/TESTER-HYBRIDE
NACH
DER
ERSTEN
SUBTRAKTIVEN
HYBRIDISIERUNG
.
45
3.17.3.10
AMPLIFIKATION
DES
ERSTEN
DIFFERENZPRODUKTES
(DP1)
.
46
3.17.3.11
VORBEREITUNG
DES
DP1
FUER
DIE
ZWEITE
SUBTRAKTIVE
HYBRIDISIERUNG
.
46
3.17.3.12
ZWEITE
SUBTRAKTIVE
HYBRIDISIERUNG
.
46
3.17.3.13
AMPLIFIKATION
DER
TESTER/TESTER-HYBRIDE
NACH
DER
ZWEITEN
SUBTRAKTIVEN
HYBRIDISIERUNG
.
46
3.17.3.14
AMPLIFIKATION
DES
ZWEITEN
DIFFERENZPRODUKTES
(DP2)
.
46
3.17.3.15
VORBEREITUNG
DES
DP2
FUER
DIE
DRITTE
SUBTRAKTIVE
HYBRIDISIERUNG
.
46
3.17.3.16
DRITTE
SUBTRAKTIVE
HYBRIDISIERUNG
.
46
3.17.3.17
AMPLIFIKATION
DER
TESTER/TESTER-HYBRIDE
NACH
DER
DRITTEN
SUBTRAKTIVEN
HYBRIDISIERUNG
.
47
3.17.3.18
AMPLIFIKATION
DES
DRITTEN
DIFFERENZPRODUKTES
(DP3)
.
47
3.17.3.19
VORBEREITUNG
DES
DP3
FUER
DIE
VIERTE
SUBTRAKTIVE
HYBRIDISIERUNG
.
47
3.17.3.20
VIERTE
SUBTRAKTIVE
HYBRIDISIERUNG
.
47
3.17.3.21
AMPLIFIKATION
DER
TESTER/TESTER-HYBRIDE
NACH
DER
VIERTEN
SUBTRAKTIVEN
HYBRIDISIERUNG
.
47
3.17.3.22
AMPLIFIKATION
DES
VIERTEN
DIFFERENZPRODUKTES
(DP4)
.
47
3.17.3.23
KLONIERUNG
DES
D0/T35-DP4
IN
PUC18
.
47
3.17.3.24
KOLONIEHYBRIDISIERUNG
ZUR
SELEKTION
DER
TRANSFORMANTEN
.
47
3.17.3.25
ORDNEN
DER
GEPICKTEN
CDNA-RDA-KLONE
IN
MIKROTITERPLATTEN
UND
ZUR
HYBRIDISIERUNG
AUF
NYLON
MEMBRANEN
.
48
3.17.4
TDF-ARRAYS
.
48
3.17.4.1
AMPLIFIKATION
DER
TDFS
UND
HERSTELLUNG
DER
TDF-ARRAYS
.
48
3.17.4.2
HERSTELLUNG
DER
KOMPLEXEN
CDNA-SONDEN
UND
HYBRIDISIERUNG
DER
TDF-ARRAY-FILTER
.
48
INHALTSVERZEICHNIS
4
ERGEBNISSE
.
49
TEIL
I
AUXININDUZIERTE
GENEXPRESSION
IN
SCHLIESSZELLEN
.
49
4.1
SCHLIESSZELLEN
ISOLIERTER
EPIDERMISSTREIFEN
ALS
EXPERIMENTELLES
SYSTEM
.
50
4.2
CDNA-AFLP
ANALYSE
.
51
4.2.1
HONNONBEHANDLUNG
DES
GEWEBES
.
51
4.2.2
CDNA-AFLP
.
52
4.2.3
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
SENSITIVITAET
DER
CDNA-AFLP
ANALYSE
.
59
4.3
CDNA-RDA.
.
62
4.3.1
ERSTELLEN
EINER
GEORDNETEN
DIFFERENZBIBLIOTHEK
.
63
4.3.2
IDENTIFIZIERUNG
EINZELNER
TDFS
DES
D0/T35-DP4
.
63
4.4
NACHWEIS
DER
DLFFERENZLELLEN
EXPRESSION
DER
CDNA-AFLP
UND
-RDA
TDFS
DURCH
HYBRIDISIERUNG
VON
TDF-ARRAYS
MIT
KOMPLEXEN
CDNA-SONDEN
_
68
4.4.1
VERGLEICH
DER
GENEXPRESSION
IN
SCHLIESSZELLEN
NACH
IAA-BEHANDLUNG
.
68
4.4.2
VERGLEICH
DER
TRANSKRIPTION
IN
SCHLIESSZELLEN
NACH
BEHANDLUNG
MIT
VERSCHIEDENEN
SIGNAL
STOFFEN
.
70
TEIL
II
ISOLIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
FUER
MUTMASSLICHE
LONENTRANSPORTER
KODIERENDEN
GENE
ATCNBTI
UND
ATCNBT2
.
73
4.5
ISOLIERUNG
EINES
ATCNBTI
VOLLAENGENKLONES
AUS
EINER
ARABIDOPSLS
THALLANA
SCHLIESSZELLEN
CDNA-BIBLIOTHEK
.
73
4.6
ANALYSE
DER
ABGELEITETEN
AMINOSAEURESEQUENZ
DES
KLONS
79N2
.
TI
4.7
SUBZELLULAERE
LOKALISIERUNG
DES
ATCNBTI
PROTEINS
.
80
4.7.1
HERSTELLUNG
DER
PCATS-ATCNBT1-GFP
KONSTRUKTE
.
80
4.7.2
TRANSIENTE
EXPRESSION
DER
ATCNBTI-GFP-FUSIONSPROTEINE
IN
BY-2
PROTOPLASTEN
.
82
4.8
ANALYSE
DER
GENOMLSCHEN
ORGANISATION
DES
ATCNBTI
GENS
.
64
4.8.1
SOUTHERN
BLOT
ANALYSE
.
84
4.8.2
KARTIERUNG
DES
ATCNBT
1
GENS
.
86
4.8.2.1
HYBRIDISIERUNG
DER
CIC-YAC-BIBLIOTHEK
MIT
EINER
ATCNBTI
CDNA-SONDE
.
86
4.8.2.2
HYBRIDISIERUNG
DER
IGF-BAC-BIBLIOTHEK
MIT
EINER
ATCNBTI
CDNA-SONDE
.
89
INHALTSVERZEICHNIS
4.9
ISOLIERUNG
DES
ATCNBTI
PROMOTERS
.
91
4.9.1
INVERSE
PCR
ZUR
ISOLIERUNG
FLANKIERENDER
GENOMISCHER
BEREICHE
.
91
4.9.2
ISOLIERUNGDESPROMOTORS
.
92
4.10
ISOLIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
DES
ATCNBT2GENS
UND
DES
ATCNBT2
PROMOTORS
.
95
4.11
VERGLEICHENDE
ANALYSE
DER
STRUKTUREN
VON
ATCNBTI
UND
ATCNBT2
AUF
NUKLELNSAEURE
UND
AMINOSAEUREEBENE
.
98
4.11.1
DIE
GENOMISCHE
SEQUENZ
DES
ATCNBT
1
GENS
.
98
4.11.2
VERGLEICH
DER
SEQUENZEN
VON
ATCNBTI
UND
ATCNBT2
.
98
4.12
EXPRESSIONSANALYSE
VON
ATCNBTI
UND
ATCNFL72
DURCH
QUALITATIVE
RT-PCR
.
101
4.13
AFCNBTI-PROMOTOR-REPORTERGEN
STUDIEN
.
103
4.13.1
HERSTELLUNG
DER
AFCNSSTI-PROMOTOR-REPORTERGEN
T-DNA-KONSTRUKTE
.
103
4.13.2
SELEKTION
TRANSGENER
PATCNBT1-GUS
UND
PATCNBTI-GFP-PTTANZEN
UND
ANALYSE
EINZELNER
INDIVIDUEN
DER T1-GENERATION
.
105
4.14
HERSTELLUNG
DER
ATCAIBTS-PROMOTOR-REPORTERGEN
T-DNA-KONSTRUKTE
.
108
4.15
ISOLIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
EINER
ATCNBT1::ENF-LNSERTIONSMUTANTE
.
109
4.15.1
IDENTIFIZIERUNG
VON
ZWEI
PFLANZEN
MIT
UNABHAENGIGEN
ENMNSERTIONEN
IN
ATCNBTI
.
109
4.15.2
IDENTIFIZIERUNG
HOMOZYGOTER
ATENBF1:;EN
F-LNSERTIONSMUTANTEN
.
111
4.15.3
BESTIMMUNG
DER
EN
1-KOPIENZAHL
IN
DEN
PFLANZENLINIEN
8M10-13
UND
7J66(2)-26
.
116
4.15.4
ANALYSE
HOMOZYGOTER
AFCNBFL.
'
.ENL-LNSERTIONSMUTANTEN
.
116
4.15.4.1
UNTERSUCHUNGEN
DES
PHAENOTYPS
.
116
4.15.4.2
ANALYSE
DER
ATCNBTI
EXPRESSION
IN
ATCNBT1:;EN1-LNSERTIONSMUTANTEN
.
119
5
DISKUSSION
.
121
TEIL
I
AUXININDUZIERTE
GENEXPRESSION
IN
SCHLIESSZELLEN
.
121
5.1
SCHLIESSZELLEN
ISOLIERTER
EPIDERMISSTREIFEN
ALS
EXPERIMENTELLES
SYSTEM
.
121
5.2
DIE
DIFFERENZIELLEN
KLONIERUNGSTECHNIKEN
.
122
5.2.1
SENSITIVITAET
DER
CDNA-AFLP
ANALYSE
.
123
5.2.2
SENSITIVITAET
DER
CDNA-RDA
.
124
5.2.3
ARTEFAKTE
DER
CDNA-RDA
.
124
5.3
AUXININDUZIERTE
SYNTHESE
CYTOPLASMATLSCHER
RRNA
IN
SCHLIESSZELLEN
.
125
INHALTSVERZEICHNIS
5.4
HYBRIDISIERUNG
DER
TDF-ARRAYS
MIT
KOMPLEXEN
CDNA-SONDEN
ALS
NACHWEIS
DLFFERENZIELLER
TRANSKRIPTION
.
126
5.4.1
INDUKTION
DER
IDENTIFIZIERTEN
TRANSKRIPTE
DURCH
ANDERE
STIMULI
.
128
5.5
FUNKTIONALE
CHARAKTERISIERUNG
DER
ISOLIERTEN
TOFS
.
128
5.5.1
KATEGORIE
"UNKLAR":
TDFS
MIT
NICHT
BESTIMMBARER
FUNKTION
.
129
5.5.2
GENEXPRESSION
.
129
5.5.3
STOFF
UND
ENERGIEWECHSEL
.
131
5.5.4
SIGNALTRANSDUKTION/PATHOGENABWEHR
.
133
5.6
ISOLIERUNG
VON
VOLLSTAENDIGEN,
ZU
DEN
TDFS
KORRESPONDIERENDEN
CDNAS
.
135
TEIL
II
ISOLIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
FUER
MUTMASSLICHE
LONENTRANSPORTER
KODIERENDEN
GENE
ATCNBTI
UND
ATCNBT2
.
137
5.7
GENOMISCHE
ORGANISATION
DER
GENE
ATCNBTI
UND
ATCNBT2
_
137
5.8
LOKALISIERUNG
DES
ATCNBT1-GFP-FUSLONSPROTELNS
IN
PROTOPLASTEN
DER
TABAK
BY-2-ZELLINLE
.
139
5.9
STRUKTUR
UND
MEMBRANTOPOLOGIE
DER
ATCNBT
PROTEINE
.
139
5.10
VERGLEICHENDE
EXPRESSIONSANALYSEN
DER
GENE
ATCNBTI
UND
ATCNBT2.
.
142
5.10.1
RT-PCR
.
143
5.10.2
PROMOTOR-REPORTERGEN
STUDIEN
.
144
5.11
ISOLIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
ATCNBTL.'.-ENL-INSERTLONSMUTANTEN
.
145
5.12
FUNKTIONSANALYSEN
.
146
6
ZUSAMMENFASSUNG
UND
PERSPEKTIVEN
.
147
TEIL
I
AUXININDUZIERTE
GENEXPRESSION
IN
SCHLLESSZELLEN
.
147
TEIL
II
ISOLIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
FUER
MUTMASSLICHE
LONENTRANSPORTER
KODIERENDEN
GENE
ATCNBTI
UND
ATCNBT2
.
149
INHALTSVERZEICHNIS
7
LITERATURVERZEICHNIS
.
151
8
ANHANG
.
161
ANHANG
A
TDF-SEQUENZEN
.
161
ANHANG
B
AUTORADIOGRAMME
DER
TDF-ARRAY-HYBRLDLSLERUNGEN
.
172
ANHANG
C
VOLLSTAENDIGE
DNA-SEQUENZ
DER
GENE
ATCNBT2
UND
ATCNBTI
AUT
CHROMOSOM
111
VON
ARABIDOPSIS
THALIANA
OEKOTYP
COLUMBIA
0
.
173
ANHANG
D
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
.
180
ANHANG
E
TABELLENVERZEICHNIS
.
182
ANHANG
F
GLOSSAR
.
183
ANHANG
G
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
184 |
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