Verfahren zur extrazellulären Produktion rekombinanter Proteine mit Gram-negativen Bakterien:
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|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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1999
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
---------------------------------------------------------------------------------------
1
1.1
A
UFGABENSTELLUNG
.
2
2
THEORETISCHER
HINTERGRUND
3
2.
J
E
SCHERICHIA
COU
UND
DER
PERIPLASMATISCHE
R
AUM
.
3
2.2
S
EKRETIONSSYSTEME
IN
DER
B
IOTECHNOLOGIE
.
4
2.2.1
HEFEN
.
5
2.2.2
SCHIMMELPILZE
.
6
2.2.3
PROTEINSEKRETION
BEI
GRAM-POSITIVEN
BAKTERIEN
.
8
2.3
E
XPORT
VON
P
ROTEINEN
IN
DAS
P
ERIPLASMA
VON
E
SCHERICHIA
COU
.
10
2.3.1
EINFLUSS
VERSCHIEDENER
SIGNALPEPTIDE
AUF
DEN
EXPORT
REKOMBINANTER
PROTEINE
.
11
2.4
S
EKRETION
VON
P
ROTEINEN
IN
DAS
K
ULTURMEDIUM
VON
E
SCHERICHIA
COU
.
12
2.4.1
SEKRETION
VON
PROTEIN
A-FUSIONSPROTEINEN
.
13
2.4.2
EIN-SCHRITT
SEKRETION
VON
HAEMOLYSIN
IN
DAS
KULTURMEDIUM.
14
2.4.3
EIN-SCHRITT
SEKRETION
FI
LAMENTOESER
PHAGEN
.
16
2.4.4
PROTEINTRANSPORT
UEBER
DIE
AEUSSERE
BAKTERIENMEMBRAN
.
16
2.4.5
UNSPEZIFISCHE
SEKRETIONSSYSTEME
.
17
2.4.6
BR-PROTEIN-KATALYSIERTE
SEKRETION
.
17
2.4.7
SEKRETION
HETEROLOGER
PROTEINE
DURCH
BRPS
.
19
2.4.8
WACHSTUMSPHASEN-ABHAENGIGE
INDUKTION
VON
BR-PROTEINEN
.
20
2.5
S
TATIONAERE
W
ACHSTUMSBEDINGUNGEN
.
21
2.6
P
ROTEIN
A
UFARBEITUNG
.
23
2.6.1
METALL-CHELAT-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
24
3
MATERIAL
UND
METHODEN
---------------------------------------------------------------------------------
26
3.1 G
ERATE
.
26
3.2
C
HEMIKALIEN
.
27
3.3
B
AKTERIENSTAMME
.
29
3.4
P
LASMIDE
UND
TRANSPONIERBARE
E
LEMENTE
.
29
3.5
B
AKTERIENKULTIVIERUNG
.
35
3.5.1
MEDIEN
.
35
3.6
E
NZYMTESTS
.
36
3.6.1
GLUKOSEBESTIMMUNG
.
36
3.6.2
GLYCERINBESTIMMUNG
.
37
3.6.3
SS-GLUCANASE-AKTIVITAETSTESL
.
38
3.6.4
PEKTATLYASE-AKTIVITAETSTEST
.
41
3.6.5
ISOCITRAT-DEHYDROGENASE
.
42
3.6.6
ALKALISCHE
PHOSPHATASE
.
42
3.7
P
ROTEIN
A
NALYTIK
.
43
3.7.1
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
MIT
DEM
BCA-TEST
.
43
3.7.2
ROTI-NANOQUANT-PROTEINBESTIMMUNG
.
45
3.7.3
HORIZONTALE
SDS-GELELEKTROPHORESE
MIT
DEM
PHASTSYSTEM
.
45
3.7.4
FAERBUNG
DER
PHASTSYSTEM-GELE
.
45
3.7.5
VERTIKALE
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
.
46
3.7.6
SILBERFAERBUNG
DER
12
%IGEN
POLYACRYLAMIDGELE
.
47
3.8
I
MMUNOLOGISCHE
N
ACHWEISVERFAHREN
.
47
3.8.1
WESTERN-BLOT
.
47
3.8.2
DOT-BLOT
.
48
3.9
T
RANSFORMATION
VON
E
SCHERICHIA
COU
.
49
3.9.1
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ZELLEN
.
49
3.9.2
TRANSFORMATION
.
49
3.10
Z
ELLFRAKTIONIERUNG
.
49
3.11
Z
ELLAUFSCHLUBVERFAHREN
.
50
3.11.1
KUGELMUEHLEN-AUFSCHLUSS
.
50
3.11.2
ULTRASCHALLAUFSCHLUSS
.
50
3.11.3
HOCHDRUCK-ZELLAUFSCHLUSS
.
50
3.12
F
ERMENTATION
.
50
3.12.1
ANTIBIOTIKA
.
54
3.12.2
GLYCERINKULTUREN
.
54
INHALTSVERZEICHNIS
3.13
METALLCHELAT-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
MIT
N
I
-NTA-A
GAROSE
.
54
4
ERGEBNISSE
UND
DISKUSSION
------------------------------------------------------------------------------
56
4.1
E
XPRESSION
UND
EXTRAZELLULAEREN
A
NREICHERUNG
EINER
HYBRIDEN
B
AC
/
LLW
-
B
-G
LUCANASE
IN
E
SCHERICHIA
COLI
JM
109
P
LF3
.
56
4.1.1
FERMENTATION
VON
ESCHERICHIA
COLI
JM109
PLF3
MIT
LB-(GN)-MEDIUM
.
56
4.1.2
FERMENTATION
VON
ESCHERICHIA
COLI
JM109
PLF3
MIT
ZUFUETTERUNG
VON
LB-MEDIUM
.
59
4.1.3
FERMENTATION
VON
ESCHERICHIA
COLI
JM109
PLF3
MIT
TB-(GN)-MEDIUM
.
61
4.2
I
NDUZIERBARE
E
XPRESSION
DES
HYBRIDEN
B
-G
LUCANASE
-G
ENS
DURCH
V
ERWENDUNG
DES
V
EKTORS
P
ET20
B
-
BGL
-
SEC
IN
E
SCHERICHIA
COLI
.
65
4.2.1
AGARPLATTENDIFFUSIONSTEST
.
65
4.2.2
FERMENTATION
VON
ESCHERICHIA
COLI
BL21(DE3)
PET20B-BGL-SEC
IN
TB-(GN)-MEDIUM
.
66
4.2.3
STATIONAERPHASEN-INDUZIERTE
PRODUKTION
UND
SEKRETION
DER
BNCFFLUS-SS-GLUCANASE
BEI
ESCHERICHIA
COLI
BL21(DE3)
PET20B-BGL-SEC
.
67
4.3
E
XPRESSION
UND
S
EKRETION
DER
P
EKTATLYASE
AUS
E
RWINIA
CAROTOVORA
IN
E
SCHERICHIA
COU
.71
4.3.1
KULTIVIERUNG
VON
ESCHERICHIA
COLI
BL2
1
(DE3)
PST2
MIT
TB-(GN)-MEDIUM
.
72
4.3.2
FERMENTATION
DES
PEKTATLYASE-SEKRETIONSSTAMMES
ESCHERICHIA
COLI
BL2
1
(DE3)
PST2
MIT
TB
(GN)-MEDIUM
.
73
4.4
K
LEBSIELLA
PLANTICOLA
ALS
NEUER
E
XPRESSIONS
-
UND
S
EKRETIONSORGANISMUS
FUER
REKOMBINANTE
P
ROTEINE
.
74
4.4.1
WACHSTUMSVERSUCHE
MIT
KLEBSIELLA
PLANTICOLA
(RF)-LF3
IN
KOMPLEXEN
MEDIEN
.
75
4.4.2
WACHSTUMSVERSUCHE
MIT
KLEBSIELLA
PLANTICOLA
(RF)-KIL3/19
PRS201L-TC
IN
SYNTHETISCHEN
MEDIEN
76
4.4.3
FERMENTATION
DES
KTEBSIEUA-SEKRETIONSSTAMMS
KP(RF)-KIL3/19
PRS20!L-TC
MIT
ZUFUETTERUNG
VON
LB-MEDIUMKONZENTRAT
UEBER
DIE
AENDERUNG
DES
SAUERSTOFFPARTIALDRUCKS
.
78
4.4.4
FERMENTATION
DES
K/EBSFEHA-SEKRETIONSSTAMMS
KP(RF)-KIL3/19
PRS201L-TC
MIT
SUPPLEMENTIERTEM
M9-MEDIUM
.
80
4.4.5
KULTIVIERUNG
DES
KZEBSIE/FA-KONTROLLSTAMMS
(KIL)
KP(RF)
PRS201L-TC
.
82
4.4.6
ZULAUFKULTIVIERUNG
DES
KLEBSIELLA
PZUNRZCOZA-SEKRETIONSSTAMMS
KP(RF)-KIL3/L9
PRS201L-TC
MIT
M9-(GN)-MEDIUM
UND
ZUFUETTERUNG
VON
GLUKOSE
UEBER
DIE
COJ-KONZENTRATION
IN
DER
ABLUFT
(I)
.
83
4.4.7
ZULAUFKULTIVIERUNG
VON
KLEBSIELLA
PLANTICOLA
(R0-KIL3/19
PRS201L-TC
MIT
M9-(GN)
MEDIUM
UND
GLUKOSEZUFUETTERUNG
UEBER
DIE
COJ-KONZENTRATION
IN
DER
ABLUFT
(II)
.
86
4.4.8
ZULAUFKULTIVIERUNG
VON
KLEBSIELLA
PLANTICOLA
(RF)-KIL3/I9
PRS201L-TC
MIT
M9-(GNF
MEDIUM
UND
KONSTANTER
GLUKOSEZUFUETTERUNG
.
88
4.4.9
ENTWICKLUNG
EINES
KULTIVIENINGSVERFAHRENS
IM
SCHUETTELKOLBENMABSTAB
ZUR
SELEKTIVEN
EXTRAZELLULAEREN
ANREICHERUNG
DER
BACIZZUS-SS-GLUCANASE
NACH
UEBEREXPRESSION
IN
KLEBSIELLA
PLANTICOLA
(RF)-KIL3/I9
PRS201L-TC
.
91
4.4.10
ENTWICKLUNG
EINES
KULTIVIERUNGSVERFAHRENS
IM
SCHUETTELKOLBENMABSTAB
ZUR
SELEKTIVEN
EXTRAZELLULAEREN
ANREICHERUNG
DER
HYBRIDEN
BACIZZUS-SS-GLUCANASE
NACH
UEBEREXPRESSION
IN
ESCHERICHIA
COLI
B121
(DE3)
PET20B-BGL-SEC
.
93
4.5
FPLC-A
UFARBEITUNG
HISTIDINREICHER
P
ROTEINE
MIT
N
I
-NTA-A
GAROSE
.
94
4.5.1
ENTWICKLUNG
EINER
EIN-SCHRITT-AUFREIMGUNG
EINES
SS-GLUCANASE-HIS
6
-FUSIONSPROTEINS
NACH
UEBEREXPRESSION
UND
STATIONAERPHASENINDUZIERTER
ANREICHERUNG
IM
MEDIUM
VON
ESCHERICHIA
COLI
BL2KDE3)
PET20B-BGL-SEC
.
95
4.5.2
EXPRESSION
UND
AUFREINIGUNG
EINES
HIS^GFP-FUSIONSPROTEINS
.
99
4.5.3
FPLC-AUFREMIGUNG
DES
HISACTOPHILIN-GFP-FUSIONSPROTEINS
.
106
5
ZUSAMMENFASSUNG
110
6
LITERATURVERZEICHNIS
_
113
7
ANHANG
_
128 |
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