Enzymkinetik: Theorie und Methoden
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Weinheim [u.a.]
Wiley-VCH
2000
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adam_text | Titel: Enzymkinetik
Autor: Bisswanger, Hans
Jahr: 2000
Inhalt
Symbole und Abkiirzungen XIII
Einleitung I
1 Multiple Gleichgewichte 5
1.1 Diffusion 5
1.2 Wcchselwirkung von Ligandcn mit Makromolckiilen 10
1.2.1 Bindungskonstantcn 10
1.2.2 Hcrlcitung der Bindungsgleichung 11
1.3 Makromolektile mit identischen, unabhiingigen Bindungsstellen 12
1.3.1 Allgcmeine Bindungsgleichung 12
1.3.2 Graphische Darstellungen der ailgemeinen Bindungsgleichung 18
1.3.2.1 Direkte Auswertung 18
1.3.2.2 Auswertung von Bindungskurven aus optischen Tilrationsverfahren 20
1.3.3 Bindung verschicdener Liganden, Kompetition 23
1.4 Makromolektile mit nicht-idcntischen, unabhiingigen Bindungs-
stellen 27
1.5 Makromolektile mit identischen, sich beeinflussenden Bindungsstellen,
Kooperativitiit 30
1.5.1 Hill-Gleichung 30
1.5.2 Adair-Gleichung 32
1.5.3 Paulingsches Modell 33
1.5.4 Allosterische Enzyme 34
1.5.5 Symmetrie-Modcll 34
1.5.6 Sequenz-Modell und negative Kooperativitiit 39
1.5.7 Physiologische Aspektc der Kooperativitiit 43
1.5.8 Nachwcis der Kooperativitiit 46
1.5.9 Bcispielc allosterischcr Enzyme 48
1.5.9.1 Hamoglobin 48
1.5.9.2 Aspartat-Transcarbamylase 49
1.5.9.3 Aspartokinase 49
1.5.9.4 Andere Beispiele 50
1.6 Nicht-identische, sich becinflussende Bindungsstellen 51
1.7 Literatur 51
2 Enzymkinetik 53
2.1 Reaktionsordnung 53
2.1.1 Reaktionen erster Ordnung 53
X Inhalt
2.1.2 Rcaktionen zweiter Ordnung 55
2.1.3 Reaktionen nulller Ordnung 56
2.2 Steady-State-Kinetik und Michaclis-Mcntcn-Glcichung 57
2.2.1 Hcrlcitung der Michaclis-Menten-Glcichung 57
2.3 Auswcrtung enzymkinetischer Datcn 60
2.3.1 Graphische Darstcllung dcr Michaelis-Menten-Gleichung 60
2.3.1.1 Nicht-lineare Darstellungcn 60
2.3.1.2 Direkt-lincarc Diagramme 66
2.3.1.3 Lincarisicrungsvcrfahrcn 68
2.3.1.4 Graphische Auswertung von Zcit-Umsatz-Kurven 71
2.3.1.5 Integriertc Michaelis-Mcnten-Gleichung 71
2.3.2 Ermittlung der Reaktionsgcschwindigkeit 74
2.3.2.1 Experimentellc Bestimmung 74
2.3.2.2 Graphische Verfahren 75
2.4 Reversible Enzymreaktioncn 78
2.4.1 Geschwindigkcitsgleichung fur reversible Enzymreaktioncn 78
2.4.2 Haldanc-Bezichung 80
2.4.3 Produklhemmung 81
2.5 Enzymhemmung 84
2.5.1 Reversible Enzymhemmung 84
2.5.1.1 Allgemcinc Geschwindigkeitsgleichung 84
2.5.1.2 Nieht-kompetitive Hcmmung, graphische Darstellung
von Hemmdatcn 87
2.5.1.3 Kompetitive Hcmmung 94
2.5.1.4 Unkompetitive Hcmmung 97
2.5.1.5 Particllc Hemm-Mechanismen, partiell nicht-kompetitive Hemmung 99
2.5.1.6 Partiell unkompetitive Hcmmung 101
2.5.1.7 Partiell kompetitive Hemmung 102
2.5.1.8 Nicht- und unkompetitive Produkthemmung 105
2.5.1.9 Substrathemmung 106
2.5.2 Irreversible Enzymhemmung 108
2.5.2.1 Unterschcidung reversibler und irrevcrsibler Hemmstoffe 108
2.5.2.2 Charakterisicrung irreversiblcr Hcmmungen 109
2.5.3 Enzymreaktioncn mit zwei konkurrierenden Substraten 111
2.6 Mchrsubstrat-Reaktionen 113
2.6.1 Nomenklatur 113
2.6.2 Random-Mechanismus (Zufalls-Mechanismus) 114
2.6.3 O/r/e/eJ-Mechanismus fgeordneter Mechanismus) 118
2.6.4 P/bg-Pong-Mechanismus 121
2.6.5 Haldane-Beziehungen bci Mehrsubstrat-Reaktionen 123
2.6.6 Mechanismen mit mehr als zwei Substraten 124
2.6.7 Andere Schreibweisen fur Mehrsubstratreaktionen 126
2.7 Herleitung von Gcschwindigkeitsgleichungen komplexer
Enzymmechanismcn 126
2.7.1 King-Altman-Verfahren 126
2.7.2 Vereinfachtes Verfahren nach der Graphentheorie 132
Inhalt
2.7.3 Kombination von Gleichgcwichts- und Steady-State-Annahmen
2.8 Kinetische Bchandlung allosterischer Enzyme 135
2.8.1 Hystcretische Enzyme 135
2.8.2 Kinetische Kooperativitiit, Slow-Transition-Modell 137
2.9 Spezielle Enzym-Mechanismen 138
2.9.1 Kinetik immobilisierter Enzyme 138
2.9.1.1 Externe Diffusionslimitierung 140
2.9.1.2 Interne Diffusionslimitierung 142
2.9.1.3 Hemmung immobilisierter Enzyme 144
2.9.1.4 pH- und Temperaturverhalten immobilisierter Enzyme 144
2.9.2 Polymere Substrate 145
2.10 pH- und Temperaturverhalten von Enzymen 146
2.10.1 pH-Optimumskurve und Bestimmung von pK-Werten 146
2.10.2 pH-Stabilitat von Enzymen 148
2.10.3 Thermische Stabilitat von Enzymen 149
2.10.4 Temperaturabhangigkeit enzymatischer Reaktionen 150
2.11 Isotopenaustausch 153
2.11.1 Jsotopenaustauschkinetik 153
2.11.2 Isotopeneffekte 157
2.11.2.1 Primare kinetische Isotopeneffekte 157
2.11.2.2 Einflub des kinetischcn Isotopeneffekts auf Km und V 158
2.11.2.3 Andere Isotopeneffekte 160
2.12 Anwendung statistischer Methoden in der Enzymkinetik 160
2.12.1 Allgemcine Bemerkungen 160
2.12.2 In der Enzymkinetik gebrauchlichc statistische Begriffe 164
2.13 Literatur 166
3 Methoden 169
3.1 Methoden zur Bestimmung multipler Gleichgewichte 169
3.1.1 Gleichgewichtsdialyse und allgemeine Aspekte von Bindungs-
messungen 171
3.1.1.1 Prinzip der Gleichgewichtsdialyse 171
3.1.1.2 Kontrollexperimente und Fehlerquellen 173
3.1.2 Konlinuierliche Gleichgewichtsdialyse 177
3.1.3 Ultrafiltration 179
3.1.4 Gelfiltration 181
3.1.4.1 Batchverfahren 181
3.1.4.2 Elution breiter Zonen 182
3.1.4.3 Verfahren nach Hummel und Dreyer 182
3.1.4.4 Verfahren nach Brumbaugh und Ackers 183
3.1.5 Ultrazentrifugationsmethoden 184
3.1.5.1 Einfache Ultrazentrifugation 184
3.1.5.2 Zentrifugationsmethode von Chanutin et al (1942) 184
3.1.5.3 Rohrzuckergradientenzentrifugation nach Draper und Hippel 186
3.2 Elektrochemische Methoden 189
XII Inllillt
3.2.1 Sauerstoffclektrode 190
3.2.2 C02-Elektrode 192
3.2.3 Potcntiometric, Oxidations-Reduktions-Potentiale 193
3.2.4 pH-Stat 193
3.2.5 Polarographie 195
3.3 Kalorimetrie 196
3.4 Spektroskopische Methoden 197
3.4.1 Absorptionsspcktroskopie 200
3.4.1.1 Lambert-Bccrschcs Gesctz 200
3.4.1.2 Spcktrale Eigenschaften von Enzymen und Ligandcn 200
3.4.1.3 Aufbau von Spcktralphotometern 204
3.4.1.4 Doppelstrahl-Spektralphotometer 207
3.4.1.5 Differenzspektroskopie 208
3.4.1.6 Doppclwellenlangen-Spektralphotometer 210
3.4.1.7 Photochemischc Aktionsspektren 211
3.4.2 Biolumineszenz 212
3.4.3 Fluoreszcnz 212
3.4.3.1 Quantcnausbeutc 212
3.4.3.2 Storungen von Fluorcszenzmessungcn 213
3.4.3.3 Fluoreszicrcndc Vcrbindungen (Fluorophore) 214
3.4.3.4 Aulbau von Spektralfluorimetern 218
3.4.3.5 Strahlungslose Energicubertragung 219
3.4.3.6 Fluorcszcnzpolarisation 221
3.4.3.7 Pulsfluorimetric 223
3.4.4 Circulardichroismus und optischc Rotationsdispersion 224
3.4.5 Infrarot- und Raman-Spektroskopie 230
3.4.5.1 IR-Spektroskopie 230
3.4.5.2 Raman-Spektroskopic 230
3.4.5.3 Anwcndungcn 231
3.4.6 Elcktroncnspinresonanz-Spektroskopie 232
3.5 Messung schneller Reaktionen 234
3.5.1 FIuBmethoden 236
3.5.1.1 Continuous-Flow-Mcthode 236
3.5.1.2 Siopped-Flow-Methode 238
3.5.1.3 Messung von Enzymreaktionen durch FIuBmethoden 242
3.5.1.4 Bcstimmung der Totzcit 243
3.5.2 Relaxationsmcthoden 244
3.5.2.1 Tcmperatursprung-Methode 245
3.5.2.2 Drucksprung-Methode 248
3.5.2.3 Feldspmng-Methode 250
3.5.3 Flash-Photolyse, Pico- und Femtosekunden-Spektroskopie 250
- ¦y4 Auswcrtung schneller kinetischer Reaktionen (Transient-Kinetik)
^•6 Literatur 256
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