Vergleichende Untersuchungen zur Genexpression persistierender und nicht persistierender Stadien von Dictyocaulus viviparus:
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
11
2
SCHRIFTTUM
13
2.1
DIE
DIKTYOKAULOSE
DES
RINDES
13
2.1.1
DER
ERREGER
13
2.1.2
VERBREITUNG
UND
WIRTSCHAFTLICHE
BEDEUTUNG
13
2.1.3
BIOLOGIE
UND
ENTWICKLUNGSZYKLUS
14
2.1.4
KLINIK
UND
PATHOGENESE
16
2.1.5
DIAGNOSE
17
2.1.6.
BEKAEMPFUNG
19
2.1.6.1
WEIDETECHNISCHE
MASSNAHMEN
20
2.1.6.2
ANTHELMINTHIKA
21
2.1.6.3
VAKZINIERUNG
22
2.2
HYPOBIOSE
23
2.2.1
FUNKTION
DER
HYPOBIOSE
25
2.2.2
REGULATION
DER
HYPOBIOSE
26
2.2.2.1
IMMUNITAET
DES
WIRTES
27
2.2.2.2
ALTERSRESISTENZ
DES
WIRTES
28
2.2.2.3
INFEKTIONSDOSIS
28
2.2.2.4
KLIMATISCHE
EINFLUESSE
29
2.2.2.5
GENETISCHE
DETERMINATION
30
2.3
GENEXPRESSION
34
2.3.1
CHROMATINSTRUKTUR
UND
TRANSKRIPTION
34
2.3.2
MODIFIKATIONEN
DES
PRIMAEREN
TRANSKRIPTES
36
2.3.2.1
INTRANUKLEAERE
RNA-PROZESSIERUNG
36
2.3.2.2
EXTRANUKLEAERE
RNA-MODIFIKATION
38
2.3.3
TRANSLATION
39
2.4
DIFFERENTIAL
DISPLAY
REVERSE
TRANSCRIPTLON-PCR
(DDRT-PCR)
40
2.4.1
PRINZIP
DER
DDRT-PCR
41
2.4.2
RNA
ALS
AUSGANGSMATERIAL
41
2.4.3
REVERSE
TRANSKRIPTION
43
2.4.4
AMPLIFIKATION
DER
CDNA
DURCH
PCR
45
2.4.5
DARSTELLUNG
DIFFERENTIELLER
CDNA-FRAGMENTE
47
2.4.5.1
DETEKTION
DURCH
AUTORADIOGRAPHIE
47
2.4.5.2
NICHTRADIOAKTIVE
DETEKTION
48
2.4.6
SENSITIVITAET
UND
LIMITIERENDE
FAKTOREN
DER
DIFFERENTIAL
DISPLAY-TECHNIK
49
23
KOMPLETTIERUNG
VON
GENFRAGMENTEN
51
2.5.1
RAPID
AMPLIFICATION
OF
CDNA
ENDS
(RACE)
51
2.5.2
RT-PCR
MIT
SL1-UND
SEQUENZSPEZIFISCHEM
PRIMER
52
2.6
CHARAKTERISIERUNG
VON
GENFRAGMENTEN
52
3
MATERIAL
UND
METHODEN
54
3.1.
PUFFER
UND
LOESUNGEN
54
3.2
MEDIEN
UND
PLATTEN
54
3.3
REAGENTIEN,
ENZYME,
REAKTIONSGEFAESSE,
REAKTIONSKITS
UND
GERAETE
54
3.4
BAKTERIEN
UND
VEKTOREN
57
3.5
VERSUCHSPLAN
57
3.6
ALLGEMEINES
ZUR
METHODE
58
3.6.1
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
58
3.6.2
REAKTIONSBEDINGUNGEN
59
3.6.3
PRIMER-DESIGN
59
3.6.4 DARSTELLUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
60
3.6.4.1
AGAROSE-GEL-ELEKTROPHORESE
61
3.OE.4.2
POLYACRYLAMID-GEL-ELEKTROPHORESE
62
3.7
ISOLIERUNG
VON
LUNGENWURMLARVEN
NACH
EXPERIMENTELLER
INFEKTION
63
3.7.1
ISOLIERUNG
AUS
DEM
KOT
63
3.7.2
ISOLIERUNG
AUS
DER
LUNGE
63
3.8
INDUKTION
DER
ENTWICKLUNGSHEMMUNG
64
3.9
ENTSCHEIDUNG
INFEKTIOESER
PARASITENSTADIEN
65
3.10
DEGRADATION
DER
PARASITENMEMBRANEN
65
3.11
RNA-ISOLIERUNG
65
3.11.1
GESAMT-RNA-ISOLIERUNG
65
3.11.2
MRNA-ISOLIERUNG
66
3.12
QUANTITATIVE
BESTIMMUNG
DER
ISOLIERTEN
RNA
66
3.12.1
BESTIMMUNG
GROESSERER
MENGEN
RNA
66
3.12.2
BESTIMMUNG
GERINGERER
MENGEN
RNA
67
3.13
DNASE-BEHANDLUNG
DER
RNA-PRAEPARATIONEN
67
3.14
DIFFERENTIAL
DISPLAY
REVERSE
TRANSCRIPTION
PCR
(DDRT
PCR)
67
3.14.1
REVERSE
TRANSKRIPTION
(RT)
67
3.14.2
AMPLIFIKATION
DER
CDNA
DURCH
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
69
3.14.2.1
CDNA-PCR-PRIMER
69
3.14.2.2
CDNA-PCR-REAKTIONSBEDINGUNGEN
69
3.14.3
DIFFERENTIAL
DISPLAY-GEL
70
3.14.3.1
DENATURIERENDES
POLYACRYLAMID-GEL
71
3.14.3.2 NATIVES
POLYACRYLAMID-GEL
72
3.14.4
PROBENAUFBEREITUNG
UND
GEL-LAUFBEDINGUNGEN
72
3.14.5
DETEKTION
DIFFERENTIELLER
BANDEN
73
3.14.5.1
AUTORADIOGRAPHIE
73
3.14.5.2 SILBERFAERBUNG
73
3.14.6
ISOLIERUNG
DIFFERENTIELLER
BANDEN
NACH
AUTORADIOGRAPHIE
74
3.14.7
ELUTION
DIFFERENTIELLER
CDNA-FRAGMENTE
74
3.14.8
REAMPLIFIKATION
ISOLIERTER
CDNA
75
3.15
KLONIERUNG
DER
PCR-PRODUKTE
76
3.15.1
AUFREINIGUNG
DER
REAMPLIFIKATE
77
3.15.2
KLONIERUNGSVEKTOR
77
3.15.3
LIGATION
78
3.15.4
TRANSFORMATION
79
3.16
PLASMID-PRAEPARATION
UND
DARSTELLUNG
DES
INSERTS
79
3.16.1
MINIPREP-ANSAETZE
79
3.16.2
MIDIPREP-ANSAETZE
80
3.16.3
DARSTELLUNG
DES
INSERTS
81
3.17
SEQUENZIERUNG
DES
INSERTS
81
3.17.1
REAKTIONSBEDINGUNGEN
BEI DER
SEQUENZIERUNG
82
3.17.2
DETEKTION
DER
SEQUENZIERUNGSPRODUKTE
83
3.17.3
SEQUENZIDENTITAETSVERGLEICH
MITTELS
EMBL-DATENBANK
83
3.18
CHARAKTERISIERUNG
VON
GENFRAGMENTEN
83
3.18.1
RAPID
AMPLIFICATION
OF
CDNA
ENDS
(RACE)
84
3.18.1.1
3'
RACE
86
3.18.1.1.1
PRIMER
DESIGN
FUER
3'
RACE
86
3.18.1.1.2
ERSTSTRANG
CDNA-SYNTHESE
88
3.18.1.1.3
AMPLIFIKATION
DER
ZIEL-CDNA
88
3.18.1.2
5'
RACE
89
3.18.1.2.1
PRIMER
DESIGN
FUER
5'
RACE
89
3.18.1.2.2
ERSTSTRANG
CDNA-SYNTHESE
91
3.18.1.2.3
C-TAILING
DER
CDNA
91
3.18.1.2.4
PCR
MIT
DC-GETAILTER
CDNA
92
3.18.1.2.5
REAMPLIFIKATION
DER
5'
RACE-CDNA
92
3.18.2
SPLICED
LEADER
1
PCR
(SL1-PCR)
92
3.18.2.1
SLL-PRIMERAUSWAHL
93
3.18.2.2
REAKTIONSBEDINGUNGEN
BEI DER
SL1-PCR
93
3.19
SPEZIFISCHE
RT-PCR
94
3.19.1
REVERSE
TRANSKRIPTION
(RT)
95
3.19.1.1
RT-PRIMER
95
3.19.1.2
RT-REAKTIONSBEDINGUNGEN
95
3.19.2
ZWEITSTRANGSYNTHESE
96
3.19.2.1
PRIMERAUSWAHL
96
3.19.2.2
REAKTIONSBEDINGUNGEN
96
3.19.3
SEQUENZSPEZIFISCHE
PCR
97
3.19.3.1
SEQUENZSPEZIFISCHE
PRIMER
97
3.19.3.2
REAKTIONSBEDINGUNGEN
98
3.20
DAF-,
AGE-1
SPEZIFISCHE
PCR
98
3.20.1
PRAEPARATIONGENOMISCHERDNA
99
3.20.2
GESAMT-RNA-ISOLIERUNG
UND
CDNA-SYNTHESE
99
3.20.3
AMPLIFIKATION
UNTER
VERWENDUNG
VON
DAF
UND
AGE-L-SPEZIFISCHEN
PRIMERN
100
3.20.3.1
DAF
UND
AGE-1
-SPEZIFISCHE
PRIMER
100
3.20.3.2
VERGLEICH
VERSCHIEDENER
POLYMERASEN
IN
DAF-/AGE-L
-PCR
100
4
ERGEBNISSE
102
4.1
ISOLIERUNG
VON
LARVEN
NACH
EXPERIMENTELLER
INFEKTION
102
4.2
DIFFERENTIAL
DISPLAY-METHODE
103
4.2.1
WAHL
DES
AUSGANGSMATERIALS
FUER
DDRT-PCR
103
4.2.2
DIFFERENTIAL
DISPLAY-GEL
103
4.2.3
DETEKTION
DIFFERENTIELLER
BANDEN
104
4.2.4
ISOLIERUNG
DIFFERENTIELLER
CDNA-FRAGMENTE
105
4.2.5
REAMPLIFIKATION
UND
AUFTRENNUNG
DER
REAMPLIFIKATE
105
4.3
DIFFERENTIELL
EXPRIMIERTE
GENE
IN
D.
VIVIPARUS
L3-I
107
4.3.1
DIFFERENTIAL
DISPLAY
107
4.3.2
REAMPLIFIKATION
109
4.3.3
KLONIERUNG
DER
DDRT-PCR-PRODUKTE
109
4.3.4
SEQUENZIERUNG
DES
INSERTS
110
4.3.5
SEQUENZIDENTITAETSVERGLEICHE
113
4.4
CHARAKTERISIERUNG
DER
DDRT-PCR-GENFRAGMENTE
116
4.4.1
RAPID
AMPLIFICATION
OF
CDNA
ENDS
(RACE)
116
4.4.2
SPLICED
LEADER
1
(SL1)
RT-PCR
117
4.4.3
SPEZIFISCHE
RT-PCR
119
4.4.4
SEQUENZIDENTITAETSVERGLEICHE
120
4.4.4.1
IDENTITAETEN
ZWISCHEN
3'
RACE-UND
SLL-PCR-PRODUKTEN
120
4.4.4.2
IDENTITAETEN
ZWISCHEN
3'
RACE-PRODUKTEN
UND
DDRT-PCR-CDNA-FRAGMENTEN
121
4.4.4.3
IDENTITAETEN
ZWISCHEN
SLL-PCR-PRODUKTEN
UND
DDRT-PCR-CDNA-FRAGMENTEN
121
4.4.4.4
IDENTITAETEN
VON
SPEZIFISCHEN
RT-PCR-PRODUKTEN
122
4.5
DAF
UND
AGE-L-PCR
123
5
DISKUSSION
125
5.1
ISOLIERUNG
VON
LUNGENWURMLARVEN
NACH
EXPERIMENTELLER
INFEKTION
126
5.2
DIFFERENTIAL
DISPLAY
REVERSE
TRANSCRIPTION
PCR
(DDRT-PCR)
128
5.2.1
AUSGANGSMATERIAL
128
5.2.2
DIFFERENTIAL
DISPLAY-GEL
128
5.2.3
DETEKTION
DIFFERENTIELLER
BANDEN
129
5.2.4
ELUTION
VON
CDNA-FRAGMENTEN
130
5.2.5
REAMPLIFIKATION
130
5.2.6
KLONIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
131
5.2.7
STADIENSPEZIFISCH
EXPRIMIERTE
GENE
IN
D.
VIVIPARUS-L3-I
133
5.3
CHARAKTERISIERUNG
VON
DDRT-PCR-CDNA-FRAGMENTEN
137
5.3.1
KOMPLETTIERUNG
VON
GENFRAGMENTEN
137
5.3.1.1
RAPID
AMPLIFICATION
OF
CDNA
ENDS
(RACE)
138
5.3.1.2
SPLICED
LEADER
1
(SLL)-PCR
139
5.3.1.3
SPEZIFISCHE
REVERSE
TRANSCRIPTION
(RT)-PCR
140
5.4
DAF
UND
AGE-L-PCR
142
5.5
ZUSAMMENFASSENDE
BEURTEILUNG
143
6
ZUSAMMENFASSUNG
145
7
SUMMARY
147
8
ANHANG
149
8.1
ABKUERZUNGEN
149
8.2
ERMITTELTE
SEQUENZEN
151
8.2.1
DDRT-PCR-CDNA-FRAGMENTE
151
8.2.2
3'
RACE-SEQUENZEN
155
8.2.3
SLL-SEQUENZEN
157
8.2.4
SPEZIFISCHE
RT-PCR-SEQUENZEN
158
83
SYMBOLE
FUER
AMINOSAEUREN
159
9
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160 |
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