Regulation der Transkription bei genitalen und kutanen humanen Papillomviren durch den zellulären Transkriptionsfaktor YY1:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1999
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INHALTSVERZEICHNIS
I.
ZUSAMMENFASSUNG
.
1
2.
EINLEITUNG
.
3
3.
MATERIAL
.
17
3.1.
CHEMIKALIEN,
REAGENZIENSYSTEME,
ENZYME,
RADIOISOTOPE
.
17
3.1.1.
CHEMIKALIEN,
REAGENZIEN
.
17
3.1.2.
FERTIGE
REAGENZIENSYSTEME
.
17
3.1.3.
ENZYME
.
18
3.1.4.
RADIOISOTOPE
.
18
3.1.5.
ANTIKOERPER
.
18
3.2.
MEDIEN
.
19
3.2.1.
MEDIEN
FUER
DIE
ZELLKULTUR
.
19
3.2.2.
MEDIEN
FUER
DIE
BAKTERIENKULTUR
.
20
3.3.
EUKARYONTE
ZELLEN
.
20
3.4.
BAKTERIEN
.
21
3.5.
NUKLEINSAEUREN
.
21
3.5.1.
SYNTHETISCH
HERSTESTELLTE
OLIGONUKLEOTIDE
.
21
3.5.1.1.
EINZELSTRAENGIGE
OLIGONUKLEOTIDE
.
22
3.5.1.2.
DOPPELSTRAENGIGE
OLIGONUKLEOTIDE
IN
GEL-RETARDATIONS-EXPERIMENTEN
.
23
3.5.2.
REKOMBINANTE
PLASMIDE
.
24
3.5.2.I.
VEKTOREN
.
24
3.5.2.2.
KONSTRUKTE
.
25
3.5.3.
LAENGENSTANDARDS
.
29
INHALTSVERZEICHNIS
4.
METHODEN
.
30
4.1.
KULTUR
UND
MANIPULATION
EUKARYONTER
ZELLEN
.
30
4.1.1.
KULTUR
EUKARYONTER
ZELLEN
.
30
4.1.2.
LANGZEITLAGERUNG
VON
ZELLEN
.
30
4.1.3.
TRANSFEKTIONEN
EUKARYONTER
ZELLEN
.
30
4.1.3.1.
CALCIUM-PHOSPHAT-KOPRAEZIPITATIONSMETHODE
.
31
4.1.3.2.
TRANSFEKTION
MIT
LIPOFECTAMINEYY-REAGENT
.
31
4.1.4.
FUNKTIONELLE
TESTS
.
32
4.1.4.1.
HERSTELLUNG
DER
ZELLEXTRAKTE
.
32
4.1.4.2.
LUCIFERASE-ASSAY
.
32
4.1.4.3.
CAT-ASSAY
.
33
4.1.4.4.
SS-GALAKTOSIDASE-ASSAY
.
33
4.2.
DNA-METHODEN
.
34
4.2.1.
DNA-PRAEPARATIONEN
.
34
4.2.2.
STANDARDMETHODEN
.
34
4.2.3.
SEQUENZIERUNG
.
34
4.2.4.
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
(PCR)
.
35
4.2.5.
BAKTERIENKULTUR
.
36
4.2.5.1.
HERSTELLUNG
UND
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
DH5A
BAKTERIEN
.
36
4.2.5.2.
HERSTELLUNG
UND
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
BL21
(DE3)
BAKTERIEN
.
36
4.2.5.3.
TRANSFORMATION
DER
E.
COLI
-
STAEMME
XL1
UND
XL2-BLUE
.
37
4.3.
EXPRESSION
UND
ISOLIERUNG
VON
PROTEINEN
.
37
4.3.1.
PRAEPARATION
VON
PROTEINEN
AUS
STABILEN
ZELLINIEN
.
3
7
4.3.2.
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
DES
HIS-YY1-FUSIONSPROTEINS
.
38
4.3.3.
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
DES
HIS
1
8E2-FUSIONSPROTEINS
.
39
4.3.4.
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
VON
GLUTATHION-S-TRANSFERASE
(GST)-FUSIONSPROTEINEN
.
40
INHALTSVERZEICHNIS
4.3.5.
GEWINNUNG
VON
KEMEXTRAKTEN
AUS
STABILEN
EUKARYONTEN
ZELLINIEN.
.
40
4.3.6.
DENATURIERENDE
DISKONTINUIERLICHE
GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
VON
PROTEINEN
.
41
4.4.
NACHWEIS
DER
PROTEINE
.
42
4.4.1.
COOMASSIE-FAERBUNG
VON
PROTEINGELEN
.
42
4.4.2.
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
.
42
4.4.3.
NACHWEIS
VON
PROTEINEN
DURCH
WESTEM-BLOT-ANALYSE
.
42
4.5.
IN
VITRO
PROTEIN-ANALYSE
.
43
4.5.1.
GEL-RETARDATIONS-EXPERIMENTE
.
43
4.5.1.1.
YYOLIGO"-HYBRIDISIERUNG
.
43
4.5.1.2.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
DER
DOPPELSTRAENGIGEN
DNA-PROBE
.
44
4.5.I.3.
BINDUNGSREAKTION
UND
GELELEKTROPHORESE
.
45
4.5.2.
IN
VITRO
PROTEIN-TRANSKRIPTION
UND
TRANSLATION
.
46
4.5.3.
PROTEIN-AFIINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
46
4.6.
RNA-METHODEN
.
47
4.6.1.
ISOLIERUNG
CYTOPLASMATISCHER
RNA
AUS
EUKARYONTEN
ZELLEN
.
47
4.6.2.
YYPRIMER-EXTENTION
"
-ANALYSE
.
48
4.6.2.1.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
DES
EINZELSTRAENGIGEN
OLIGONUKLEOTIDS
(PRIMERS)
.
49
4.6.2.2.
HYBRIDISIERUNGSREAKTION
.
49
4.6.2.3.
IN
VITRO
CDNA-SYNTHESE
.
50
5.
ERGEBNISSE
.
51
5.1.
ROLLE
DES
YYL-TRANSKRIPTIONSFAKTORS
BEI
DER
REGULATION
DES
FRUEHEN
PPJ
PROMOTORS
VON
HPV8
.
51
5.1.1.
NACHWEIS
DER
ENDOGENEN
YY1-EXPRESSION
IN
EUKARYONTEN
ZELLEN
.
52
5.1.2.
UNTERSUCHUNG
DES
YY1
-EINFLUSSES
AUF
DEN
INITIATIONSPUNKT
DER
TRANSKRIPTION
.
54
INHALTSVERZEICHNIS
5.1.3.
FUNKTIONELLE
ANALYSE
INDIVIDUELLER
YYL-BINDESTELLEN
IN
DER
P1
75
PROMOTORREGION
VON
HPV8
.
57
5.2.
ANALYSE
DER
INTERAKTION
ZWISCHEN
YY1
-
UND
E2-PROTEIN
MITTELS
PROTEIN-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
59
5.2.1.
NACHWEIS
DER
YY1-E2
INTERAKTION
IN
VITRO
.
59
5.2.2.
CHARAKTERISIERUNG
DER
YY1-E2
INTERAKTIONSDOMAENEN
.
63
5.2.2.1.
KARTIERUNG
DER
E2-BINDEDOMAENE(N)
IM
YYL-PROTEIN
.
63
5.2.2.2.
CHARAKTERISIERUNG
DER
YY1-BINDEDOMAENE(N)
IM
HPV8
E2
PROTEIN
.
66
5.3.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
FUNKTIONELLEN
BEDEUTUNG
DER
INTERAKTION
ZWISCHEN
YY1
UND
E2
IN
VITRO
UND
IN
VIVO
.
68
5.3.1.
BINDUNG
VON
YY1
AN
SEINE
DNA-ERKENNUNGSSEQUENZ
UNTER
DEM
EINFLUSS
VON
E2
.
68
5.32.
EINFLUSS
VON
E2
AUF
DIE
YY1
-FUNKTION
IN
VIVO
.
70
5.3.3.
BINDUNG
VON
E2
AN
SEINE
ERKENNUNGSSEQUENZ
IN
GEGENWART
DES
YY1-PROTEINS
.
73
5.3.4.
PHYSIOLOGISCHE
ROLLE
DER
E2-YY1
INTERAKTION
IM
GESAMTKONTEXT
DER
NCR
VON
HPVI
8
.
75
5.3.4.1.
KOOPERATIVER
EINFLUSS
VON
YY1
UND
E2
AUF
DIE
PROMOTORAKTIVITAET
DURCH
DIE
E2-BS4
VON
HPV1
8
.
75
5.3.4.2.
SYNERGISTISCHE
AKTIVIERUNG
DES
P
56
PROMOTORS
VON
HPV18
DURCH
YY1
UND
E2
.
79
6.
DISKUSSION
.
84
7.
LITERATUR
.
96
8.
ABKUERZUNGEN
.
108 |
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