Charakterisierung und funktionelle Analyse des Proteins MEM-1 aus Zea mays L.:
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1999
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
I
ABKUERZUNGEN
VI
1,
EINLEITUNG
1
1.1.
URSPRUNG
UND
ENTWICKLUNG
DES
ENDOSPERMS
1
1.2.
DIE
SPEICHERPROTEINE
3
1.3.
DIE
REGULATION
DER
ZEIN-EXPRESSION
6
1.3.1.
MEM-1
7
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
10
2.1.
MATERIAL
10
2.1.1.
CHEMIKALIEN,
ENZYME,
KITS,
RADIOISOTOPE
UND
NAEHRMEDIEN
10
2.1.2.
E.
COLI
BAKTERIEN
UND
5.
CEREVISIAE
HEFESTAEMME
10
2.1.3.
VEKTOREN
11
2.1.4.
MEDIEN
11
2.1.5
PUFFER
UND
LOESUNGEN
12
2.1.6.
PFLANZENMATERIAL
13
2.2.
METHODEN
14
2.2.1.
BIOCHEMISCHE
METHODEN
14
2.2.1.1.
HERSTELLUNG
VON
PROTEINEXTRAKTEN
14
2.2.1.1.1.
ISOLIERUNG
VON
GESAMTPROTEIN
AUS
Z.MAYS
14
2.2.1.1.2.
ISOLIERUNG
VON
KERNPROTEINEN
AUS
Z.MAYS
14
2.2.1.1.3.
HERSTELLUNG
VON
ZYTOSOLISCHEN
EXTRAKTEN
15
2.2.1.1.4.
PRAEPARATION
VON
THERMOSTABILEM
EXTRAKT
15
2.2.1.1.5.
ISOLIERUNG
DER
PROTEINKOERPERFRAKTION
15
2.2.1.1.6.
ISOLATION
VON
TUBULIN-ASSOZIIERTEN
PROTEINEN
16
2.2.1.1.7.
ISOLIERUNG
VON
HEFEPROTEINEN
16
2.2.1.2.
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
17
2.2.1.3.
GELELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
PROTEINEN
17
2.2.1.3.1.
PROBENVORBEREITUNG
17
2.2.1.3.2.
TRENNUNG
VON
PROTEINEN
DURCH
DENATURIERENDE
SDS-POLYACRYL
18
AMIDGEL-ELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
2.2.1.4.
ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG
(IEF)
18
2.2.1.5.
FAERBUNG
VON
PROTEINEN
19
H
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.1.6.
ELEKTROTRANSFER
VON
PROTEINEN
AUF
EINE
NITROZELLULOSEMEMBRAN
(TANK-BLOTTING)
19
2.2.I.7.
IMMUNODETEKTION
VON
PROTEINEN
19
2.2.2.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
20
2.2.2.1.
ISOLIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
20
2.2.2.1.1.
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
DNA
AUS
Z.MAYS
20
2.2.2.I.2.
ISOLIERUNG
VON
POLY(A)
+
-RNA
AUS
Z.MAYS
21
2.2.2.1.3.
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
E.COLI
21
2.2.2.1.4.
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
S.CERVISIAE
22
2.2.2.2.
GELELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
22
2.2.2.2.I.
AUFTRENNUNG
VON
DNA
UND
RNA
IN
NATIVEN
AGAROSEGELEN
22
2.2.2.2.2.
AUFTRENNUNG
VON
DNA
UND
RNA
IN
NATIVEN
ODER
DENATURIERENDEN
POLYACRYLAMIDGELEN
23
2.2.2.23.
EMSA
-
ELECTROPHORETIC
MOBILITY
SHIFT
ASSAY:
AUFTRENNUNG
VON
PROTEIN-NUKLEINSAEURE-KOMPLEXEN
IN
NATIVER
GELELEKTROPHORESE
23
2.2.23.
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
NACH
DER
GELELEKTROPHORESE
24
2.2.2.3.I.
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
NATIVEN
AGAROSEGELEN
24
2.2.23.2.
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
NATIVEN
POLYACRYLAMIDGELEN
(ELEKTROELUTION)
24
2.2.233.
ISLOLIERUNG
VON
RADIOAKTIV
MARKIERTER
RNA
AUS
DENATURIERENDEN
POLYACRYLAMIDGELEN
25
2.2.2A.
MARKIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
25
2.2.2.4.I.
MARKIERUNG
VON
RNA
MIT
RADIOISOTOPEN
DURCH
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
25
2.2.2.4.2.
MARKIERUNG
VON
RNA
MIT
RADIOISOTOPEN
DURCH
PHOSPHORYLIERUNG
DER
ENDEN
26
2.2.2.4.3.
MARKIERUNG
VON
DNA
MIT
RADIOISOTOPEN
DURCH
AUFFUELLEN
KOHAESIVER
ENDEN
26
2.2.2.5.
FILTERBINDUNGS-ASSAY
26
2.2.2.6.
DNA-MODIFIZIERENDE
REAKTIONEN
27
2.2.2.I.
AMPLIFIKATION
VON
DNA
MITTELS
PCR
(POLYMERASE
CHAIN
REACTION)
27
2.2.2.8.
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
28
2.2.2.9.
IN
VITRO
TRANSLATION
29
2.2.2.10.
IMMUNOPRAEZIPITATION
29
2.2.2.11.
EXPRESSION
UND
AUFREINIGUNG
EINES
REKOMBINANTEN
GLUTATHION
S-TRANSFERASE
(GST)-FUSIONSPROTEINS
IN
E.
COLI
30
2.2.2.12.
HERSTELLUNG
EINES
POLYKLONALEN
ANTISERUMS
30
2.2.2.13.
BAKTERIEN-UND
HEFEKULTUR:
FLUESSIGKULTUR,
LAGERUNG
UND
KRYOKONSERVIERUNG
31
2.2.2.14.
TRANSFORMATION
VON
PLASMID-DNA
IN
E.COLI
31
2.2.2.15.
TRANSFORMATION
VON
PLASMID-DNA
IN
S.CERVISIAE
(LITHIUM-ACETAT
METHODE)
32
2.2.2.16.
ERSTELLUNG
EINER
TWO-HYBRID-BIBLIOTHEK
UND
TWO-HYBRID-SCREEN
32
2.2.2.17.
LACZ-TEST
ZUR
VERIFIKATION
VON
INTERAKTIONEN
IM
TWO-HYBRID
SYSTEM
33
2.2.2.18.
VERWENDETE
PRIMER
34
INHALTSVERZEICHNIS
III
3.
ERGEBNISSE
36
3.1.
CHARAKTERISIERUNG
DER
DNA-BINDUNGSEIGENSCHAFTEN
VON
MEM-1
36
3.1.1.
CHARAKTERISIERUNG
DER
DNA-INTERAKTION
VON
MEM
1
MIT
HILFE
36
DES
ONE-HYBRID-SYSTEMS
3.1.2.
CHARAKTERISIERUNG
DER
MEM-L-DNA-INTERAKTION
IM
42
GELRETARDIERUNGSEXPERIMENT
3.1.3.
ZUSAMMENFASSUNG
DER
DNA-BINDUNGSAKTIVITAET
VON
MEM
1
43
3.2.
EXPRESSION
UND
LOKALISATION
VON
MEM-1
44
3.2.1.
HERSTELLUNG
DES
MEM
1
ANTISERUMS
44
3.2.2.
EXPRESSION
VON
MEM-1
45
3.2.3.
SUBZELLULAERE
LOKALISATION
VON
MEM-1
47
3.2.4.
ASSOZIATION
VON
MEM-1
MIT
MIKROTUBULI
49
3.2.5.
TWO-HYBRID-SCREEN
MIT
MEM-1
54
3.2.6.
ASSOZIATION
VON
MEM-1
MIT
PROTEINKOERPERN
58
3.2.7.
ZUSAMMENFASSUNG
DER
CHARAKTERISIERUNG
VON
MEM
1
63
3-3.
RNA-BINDUNGSEIGENSCHAFTEN
VON
MEM-1
64
3.3.1.
ZUSAMMENFASSUNG
DER
RNA-BINDUNGSEIGENSCHAFTEN
VON
MEM-1
70
3.4.
ZUSAMMENFASSUNG
DER
ERGEBNISSE
DER
VERSCHIEDENEN
EXPERIMENTE
71
4.
DISKUSSION
4.1.
DNA-BINDUNGSEIGENSCHAFTEN
VON
MEM-1
72
4.2.
EXPRESSION
VON
MEM-1
74
4.3.
MIKROTUBULI-ASSOZIATION
VON
MEM-1
76
4.4.
DIE
ASSOZIATION
VON
MEM-1
MIT
PROTEINKOERPEM
80
4.5.
DIE
RNA-BINDEEIGENSCHAFTEN
VON
MEM-1
82
4.6.
MODELL
FUER
DIE
FUNKTION
VON
MEM-1
IN
DER
ENDOSPERM
84
ENTWICKLUNG
VON
Z.MAYS
4.1.
AUSBLICK
85
5.
ZUSAMMENFASSUNG
87
6.
LITERATURVERZEICHNIS
89
7.
ANHANG
100 |
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