Funktionelle und strukturelle Charakterisierung des bakteriellen Transkriptionsfaktors H-NS:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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| Veröffentlicht: |
1999
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INHALTSVERZEICHNIS
1
1
EINLEITUNG
1.1
DIE
TRANSKRIPTION
UND
IHRE
ZENTRALE
ROLLE
BEI
DER
REGULATION
DER
GENEXPRESSION
1
1.2
RNA-POLYMERASE
UND
PROMOTOR
2
1.3
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
4
1.4
DIE
DREI
PHASEN
DER
TRANSKRIPTION
4
1.4.1
DIE
INITIATION
5
1.4.1.1
DER
O-FAKTOR
5
1.4.1.2
DIE
EINZELNEN
SCHRITTE
DER
INITIATION
8
1.4.1.3
DIE
ABORTIVE
INITIATION
10
1.4.1.4
DIE
REITERATIVE
INITIATION
11
1.4.1.5
DIE
'
PROMOTORSTAERKE
'
12
1.4.2
DIE
ELONGATION
13
1.4.3
DIE
TERMINATION
15
1.5
DIE
MECHANISMEN
DER
GENREGULATION
AM
BEISPIEL
DES
RRNB
OPERONS
VON
E.
COLI
17
1.5.1
DIE
BEDEUTUNG
DER
SYNTHESE
RIBOSOMALER
RNA
FUER
DAS
ZELLWACHSTUM
17
1.5.2
AUFBAU
DER
RIBOSOMALEN
OPERONS
BEI
E.
COLI
18
1.5.3
DIE
REGULATION
DER
SYNTHESE
RIBOSOMALER
RNA
20
1.5.3.1
DIE
TANDEM-PROMOTOREN
P1
UND
P2
20
1.5.3.2
DAS
EFFEKTORMOLEKUEL
GUANOSINTETRAPHOSPHAT
21
1.5.3.3
DIE
VEADER
'
-REGION
22
1.5.3.4
DIE
UAS-REGION
UND
DIE
FAKTORUNABHAENGIGE
REGULATION
22
1.5.3.5
DIE
UAS-REGION
UND
DIE
FAKTORABHAENGIGE
REGULATION
23
1.6
FRAGESTELLUNG
UND
KONZEPTION
DER
ARBEIT
25
2
ERGEBNISSE
2.1
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
MECHANISMUS
DER
DURCH
H-NS
VERMITTELTEN
REPRESSION
DER
TRANSKRIPTION
27
2.1.1
ALLGEMEINES
27
2.1.2
DIE
GLEICHZEITIGE
BINDUNG
VON
RNA-POLYMERASE
UND
H-NS
27
2.1.3
DER
EINFLUSS
DES
CT-FAKTORS
30
2.1.4
DNA-KONFORMATION
UND
DIREKTE
PROTEIN/PROTEIN-INTERAKTION
ALS
URSACHE
DER
KOOPERATIVEN
AUSBILDUNG
DES
INITIATIONSKOMPLEXES
IN
ANWESENHEIT
VON
H-NS
33
2.1.5
DIE
STRUKTURELLEN
VERAENDERUNGEN
DES
INITIATIONSKOMPLEXES
IN
ANWESENHEIT
VON
H-NS
38
2.1.6
DER
EINFLUSS
VON
H-NS
AUF
DIE
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
46
2.2
CHARAKTERISIERUNG
VON
H-NS
UND
SEINEN
MUTANTEN
51
2.2.1
AUFREINIGUNG
UND
AKTIVITAETSASSAY
VON
HOCHREINEM
H-NS
51
2.2.2
CHARAKTERISIERUNG
VON
MUTIERTEN
H-NS
PROTEINEN
53
2.2.2.1
ALLGEMEINE
BEMERKUNGEN
53
2.2.2.2
AUFREINIGUNG
DER
MUTIERTEN
H-NS
PROTEINE
54
22.2.3
DNA-BINDUNGSSTUDIEN
MIT
H-NS,
R12C,
R54C
UND
G113D
61
2.2.3
UNTERSUCHUNGEN
ZU
EINEM
MOEGLICHEN
COFAKTOR
63
2.2.4
CD-ANALYSEN
VON
H-NS
UND
SEINEN
MUTANTEN
65
2.2.4.1
ALLGEMEINES
65
2.2
4.2
CD-MESSUNGEN
MIT
H-NS,
R12C,
G113D
UND
R54C
66
2.2.4.3
BESTIMMUNG
DER
SEKUNDAERSTRUKTURVERTEILUNGEN
VON
H-NS,
R12C,
G113D
UND
R54C
69
2.2.4.4
TEMPERATURABHAENGIGE
CD-ANALYSEN
73
3
DISKUSSION
3.1
DIE
FAKTORABHAENGIGE
REGULATION
DES
RMB
OPERONS
79
3.1.1
DIE
UNABHAENGIGE
FUNKTIONSWEISE
DER
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
H-NS
UND
FIS
79
3.1.2
DIE
BALANCIERTE
GENREGULATION
DURCH
DEN
FUNKTIONELLEN
ANTAGONISMUS
VON
FIS
UND
H-NS
85
3.1.3
DIE
ZELLULAERE
FUNKTION
VON
H-NS
88
3.2
DIE
FUNKTIONELLEN
DOMAENEN
VON
H-NS
90
3.2.1
DIE
STRUKTUR
VON
H-NS
90
3.2.2
EIN
MOEGLICHER
COFAKTOR
VON
H-NS
92
4
MATERIAL
4.1
ALLGEMEINES
94
4.2
BAKTERIENSTAEMME
UND
PLASMIDE
94
4.2.1
ESCHERICHIA
COLI
BAKTERIENSTAEMME
94
4.2.2
PLASMIDE
95
4.3
NUKLEINSAEUREN,
DESOXYOLIGONUKLEOTIDE
UND
NUKLEOTIDE
95
4.4
PROTEINE
96
4.4.1
ENZYME
UND
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
96
4.4.2
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
97
4.4.3
SONSTIGE
PROTEINE
97
4.5
PUFFER
UND
MEDIEN
97
4.6
FEINCHEMIKALIEN
98
4.7
SONSTIGE
MATERIALIEN
99
INHALTSVERZEICHNIS
III
5
METHODEN
5.1
ALLGEMEINE
MIKROBIOLOGISCHE
METHODEN
100
5.1.1
STERILISATION
VON
LOESUNGEN
UND
GLASGERAETEN
100
5.1.2
HALTUNG
UND
SICHERUNG
VON
ZELLSTAEMMEN
100
5.1.3
ANZUCHT
VON
UEN-KULTUREN
100
5.1.4
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
E.
COLI
ZELLEN
100
5.1.5
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
E.
COLI
ZELLEN
101
5.2
ALLGEMEINE
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
101
5.2.1
UV/VIS-SPEKTROSKOPIE
101
5.2.1.1
SPEKTRALPHOTOMETRISCHE
KONZENTRATIONS
UND
REINHEITSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
101
5.2.1.2
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
PROTEINEN
102
5.2.1.3
STREUMESSUNG
103
5.2.2
RADIOAKTIVITAETSMESSUNG
103
5.2.3
PHENOL/CHLOROFORM-EXTRAKTION
103
5.2.4
ETHANOLFAELLUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
103
5.2.5
DIALYSE
104
5.2.5.1
MIKROTROPFENDIALYSE
104
5.2.5.2
DIALYSE
VON
PROTEINLOESUNGEN
IM
DIALYSESCHLAUCH
104
5.2.6
ENZYMATISCHE
REAKTIONEN
104
5.2.6.1
RESTRIKTIONSHYDROLYSEN
104
5.2
6.2
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
5
'
-DNA-ENDEN
105
5.2.6.3
KLENOW-REAKTION
ZUM
AUFFUELLEN
VON
UEBERHAENGENDEN
5
'
-DNA-ENDEN
105
5.2.6.4
RADIOAKTIVE
5
'
-MARKIERUNG
DOPPELSTRAENGIGER
DNA-FRAGMENTE
106
5.2.6.5
RADIOAKTIVE
5
'
-MARKIERUNG
EINZELSTRAENGIGER
DNA-OLIGONUKLEOTIDE
106
5.2.6.6
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
107
5.2.7
ISOLATION
VON
DNA
107
5.2.7.1
ISOLIERUNG
ANALYTISCHER
MENGEN
PLASMID-DNA
107
5.2.7.2
PRAEPARATIVE
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
108
5.2.8
GELELEKTROPHORESE
109
5.2.8.1
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
109
5.2.8.2
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(PAGE)
VON
NUKLEINSAEUREN
UNTER
NATIVEN
BEDINGUNGEN
110
5.2.8.3
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(PAGE)
VON
NUKLEINSAEUREN
UNTER
DENATURIERENDEN
BEDINGUNGEN
110
5.2.8.4
DISKONTINUIERLICHE
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
111
5.2.9
NACHWEIS
VON
NUKLEINSAEUREN
UND
PROTEINEN
IN
POLYACRYLAMIDGELEN
112
5.2.9.1
SILBERFAERBUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
112
5.2.9.2
COOMASSIE-FAERBUNG
VON
PROTEINEN
113
5.Z.9.3
SILBERFAERBUNG
VON
PROTEINEN
113
5.2.9.4
ELEKTROTRANSFER
VON
PROTEINEN
FUER
DEN
IMMUNONACHWEIS
(WESTERN-BLOT)
114
5.2.9.5
IMMUNONACHWEIS
VON
PROTEINEN
114
5.2.9.6
AUTORADIOGRAPHIE
115
IV
INHALTSVERZEICHNIS
5.2.9.7
DENSITOMETRIE
115
5.2.10
PRAEPARATIVE
DNA-GELELUTION
116
5.2.10.1
DNA-GELELUTION
AUS
AGAROSEGELEN
NACH
DER
YYFREEZE-SQUEEZE"-METHODE
116
5.2.10.2
AUFREINIGUNG
SYNTHETISCHER
DESOXYOLIGONUKLEOTIDE
116
5.2.10.3
GELELUTION
VON
DNA-OLIGONUKLEOTIDEN
AUS
DENATURIERENDEN
POLYACRYLAMIDGELEN
117
5.3
SPEZIELLE
METHODEN
118
5.3.1
CHEMISCHE
DNA-MODIFIKATION
FUER
TOOFPRINF-ANALYSEN
118
5.3.1.1
ALLGEMEINES
118
5.3.1.2
CHEMISCHE
DNA-MODIFIKATION
DURCH
DIMETHYLSULFAT
ZUR
IN
VITRO
ANALYSE
VON
TRANSKRIPTIONS-INITIATIONSKOMPLEXEN
118
5.3.1.3
CHEMISCHE
DNA-MODIFIKATION
DURCH
KALIUMPERMANGANAT
ZUR
IN
VITRO
ANALYSE
VON
TRANSKRIPTIONS-INITIATIONSKOMPLEXEN
119
5.3.1.4
CHEMISCHE
DNA-MODIFIKATION
DURCH
KMNO
4
IN
VIVO
119
5.3.1.5
AUFREINIGUNG
CHEMISCH
MODIFIZIERTER
PLASMID-DNA
120
5.3.1.6
PRAEPARATION
CHROMOSOMALER
DNA
NACH
KMNO
4
-MODIFIKATION
IN
VIVO
120
5.3.2
PRIMER-EXTENSION-ANALYSE
121
5.3.3
PLASMID-DNA-SEQUENZIERUNG
122
5.3.4
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
123
5.3.4.1
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
IM
'
MULTIPLE
ROUND
'
-ANSATZ
123
5.3.4.2
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
IM
'
PSEUDO
SINGLE
ROUND
'
-ANSATZ
124
5.3.5
VERZOEGERUNGSELEKTROPHORESE
125
5.3.6
ANALYTISCHE
PRAEPARATION
VON
GESAMT-PROTEINEXTRAKTEN
126
5.3.7
PRAEPARATION
VON
H-NS
127
5.3.7.1
PRAEPARATION
VON
RIBOSOMENFREIEN
ZELLEXTRAKTEN
127
5.3.7.2
FRAKTIONIERTE
AMMONIUMSULFAT-PRAEZIPITATION
127
5.3.7.3
P11-PHOSPHOCELLULOSE
(LONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE)
128
5.3.7.4
HEPARIN-SEPHAROSE
6B
(AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE)
129
5.3.7.5
FPLC-GELFILTRATION
(TSK
BIOSEP-SEC-S400)
130
5.3.8
PRAEPARATION
VON
FIS
130
5.3.8.1
ETABLIERUNG
DES
UEBEREXPRESSIONSSYSTEMS
130
5.3.8.2
ANZUCHT,
HITZEINDUKTION
UND
ZELLAUFSCHLUSS
131
5.3.8.3
HEPARIN-SEPHAROSE
6B
(AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE)
131
5.3.8.4
S-SEPHAROSE
(LONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE)
132
5.3.9
AUFKONZENTRIERUNG
VON
PROTEINEN
132
5.3.10
CD-SPEKTROSKOPIE
133
6
LITERATURVERZEICHNIS
134
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
152 |
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