p53-Mutationsanalysen und Transfektion des p53-Tumorsuppressorgens in humane Nierenkarzinomzellinien:
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1998
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
1.1
DAS
NIERENZELLKARZINOM
1.2.
GENESE
DES
NIERENZELLKARZINOMS
1
3
DAS
P53-TUMORSUPPRESSORGEN
1.4
ZIEL
DIESER
ARBEIT
2.
MATERIAL
2.1.
CHEMIKALIEN
2.2
LOESUNGEN
UND
PUFFER
2.3
ENZYME
2.4.
KITS
2
5
OLLGONUKLEOTIDE
3.
METHODEN
XI.
KULTIVIERUNG
VON
NIERENKARZINOMZEILEN
3.1.1
KLASSIFIKATION
DER
NIERENZELLKARZINOME
31.2.
WACHSTUMSBEDINGUNGEN
UND
NAEHRMEDIUM
31.3
PASSAGE
KONFLUENT
BEWACHSENER
KULTUREN
31
4
BESTIMMUNG
DER
ZEITZAHL
3.2.
SEQUENZANALYSE
IM
P53-GEN
3.2.1.
EXTRAKTION
UND
AUFARBEITUNG
DER
DNA
3211
EXTRAKTION
UND
AUFARBEITUNG
VON
DNA
NACH
CHRGWIN
3.2.1.2.
EXTRAKTION
UND
AUFARBEITUNG
VON
DNA
MIT
DEM
QIAAMP
TISSUE
KIT
3213
EXTRAKTION
UND
AUFARBEITUNG
VON
DNA
AUS
PARAFFIN-EINGEBETTETEM
PNMAERTUMORMATENAL
UND
NORMALGEWEBE
MIT
DEM
QIAAMP
TISSUE
KIT
3.2.1
4.
PHOTOMETNSCHE
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
3
2
2.
PCR-AMPLIFIKATION
DER
P53-EXONS
1-11
3.2
2.1
DURCHFUEHRUNG
DER
PCR-REAKTIONEN
32
2.2
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
3.2.3.
IMMUNHISTOCHEMIE
3
2
4.
AUTOMATISCHE
SEQUENZIERUNG
3
25
RESTRIKTIONSANALYSE
DES
P53-POLYMORPHISMUS
IM
CODEN
72
INFALTSVTRZAICHNIS
II
3.3.
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
VON
NIERENKARZINOMZELLEN
MIT
DEM
&-GALAKTOSLDASE-GEN
3.3.1
PRAEPARATION
DER
VEKTOR-DNA
3.3.1.1.
TRANSFORMATION
VON
PCMVSS
IN
HB101-E.COLI-BAKTERIEN
3.3.1.2.
PLASMID-DNA-MINIPRAEPARATION
3.3.1.3
CHARAKTERISIERUNG
DER
PLASMID-DNA
MITTELS
RESTRIKTIONSANALYSE
3
31.4.
PLASMID-DNA-PRAEPARATION
MIT
DEM
QIAGEN
PLASMID
MEGA
KIT
3.3.2
TRANSFEKTION
VON
NIERENKARZINOMZELLEN
MITTELS
ELEKTROPORATION
3.3.2.1.
OPTIMIERUNG
DER
ELEKTROPORATION
3.3.2.2.
SS-GALAKTOSIDASE-NACHWEIS
3
3
2.3.
OPTIMIERUNG
DER
TRANSFEKTIONSEFFIZIENZ
34.
STABILE
TRANSFEKTION
VON
NIERENKARZINOMZELLEN
MIT
DEM
TUMORSUPPRESSORGEN
PS3
3.41
TRANSFEKTION
DER
VEKTOREN
P3'SS
UND
POPI3P53
3.4.2.
HERANZUECHTEN
VON
ZELLEN
UNTER
SELEKTIONSBEDINGUNGEN
3.5.
NACHWEIS
DER
TRANSFEKTION
VON
P3
'
SS
UND
POPI3P53
3.5.1
NACHWEIS
DER
TRANSFEKTION
MITTELS
PCR
3.5.2.
NACHWEIS
DER
EXPRESSION
DES
LAC-REPRESSORS
MITTELS
NORTHEM-BLOT
3.5.2.1.
AUFARBEITUNG
DER
GESAMT-RNA
MIT
DEM
QIAGEN
RNEASYYY
KIT
3.5
2.2.
FORMALDEHYDGELELEKTROPHORESE
3.5
2.3.
BLOTTMG
3.5.2
4.
HERSTELLUNG
DER
LAC-REPRESSOR
SONDE
3.5.2.5.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
DER
LAC-REPRESSOR
SONDE
3.5.2.6
HYBRIDISIERUNG
3.5.27.
WASCHUNG
DER
NYLONMEMBRANEN
3.5
2.8.
AUTORADIOGRAPHIE
DER
NORTHEM-BLOTS
3.5.3.
NACHWEIS
DER
EXPRESSION
DES
LAC-REPRESSORS
UND
DES
P53-PROTEIONS
MITTELS
WESTERN
BLOT
3.5
3.1.
PROTEINEXTRAKTION
3.5
3
2.
BESTIMMUNG
DER
PROTEINMENGE
NACH
BRADFORD
3.5.3
3
SOS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
3.5.3
4
WESTERN
BLOTTMG
3.5.3
5
FAERBUNG
DER
NITROZELLULOSEMEMBRANEN
MIT
PONCEAU
S
3.5.36.
IMMUNDETEKTION
INHTLTMMLCHNLS
III
4.
ERGEBNISSE
4.1.
PCR-AMPLFLKATLON
OES
P53-GENS
4.1.1.
PCR-AMPLIFIKATION
DES
P53-GENS
DER
ZELLINIE
DEAR-CA
26
4.1.2.
PCR-AMPLIFIKATION
DES
EXONS
9
DES
P53-GENS
DER
ZELLINIE
DEARCA-5
4.2.
TMMUNHLSTOCHEMLSCHER
NACHWEIS
DES
P53-PROTELNS
4.3.
AUSWERTUNG
DER
SEQUENZIERUNGSERGEBNISSE
4.3.1.
ABWEICHUNG
DER
GEFUNDENEN
P53-SEQUENZ
VON
DER
P53-WLLDTYPSEQUENZ
4.3
2
POLYMORPHISMUS
IM
P53-GEN
4.3
3.
MUTATIONEN
IM
P53-GEN
4.4.
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
VON
NLERENZETLKARZLNOMEN
MIT
DEM
A-GALAKTOSLDASE-GEN
4.4.1.
PRAPARATION
DER
PCMVSS-DNA
4.4.2.
OPTIMIERUNG
DER
ELEKTROPORATION
4
4
21
ELEKTROPORATIONSMEDIUM
44
2
2
KAPAZITAET
[PF]
UND
SPANNUNG
[VJ
4.4.2.3.
DNA-KONZENTRATION
4
4.2.4.
ZELLZAHL
UND
KONFLUENZ
4
4
2.5.
TEMPERATUR
4
4
2.6.
ZEITKONSTANTE
4.5.
STABILE
TRANSFEKTION
VON
NIERENKARZINOMZELLEN
MIT
DEM
LACSWITCH
INDUCLBLE
MAMMALLAN
EXPRESSION
SYSTEM
4
5.1.
SELEKTION
STABIL
TRANSFIZIERTER
KLONE
4
5.2.
NACHWEIS
DER
STABILEN
TRANSFEKTION
MIT
DER
PCR
4
5
21.
NACHWEIS
DER
LAC-REPRESSOR-DNA
4
5.2.2.
NACHWEIS
DER
TRANSFEKTION
MIT
DEM
PLASMID
POPI3P53
4.5.3.
NACHWEIS
DER
EXPRESSION
DES
LAC-REPRESSORS
MITTELS
NORTHERN
BLOT
4.5.3.1.
NACHWEIS
DER
EXPRESSION
DES
LAC-REPRESSOR-GENS
FUER
DIE
ZELLINIE
DEARCA-43
NACH
TRANSFEKTION
MIT
DEM
VEKTOR
P3'SS
4.5.3
2.
NACHWEIS
DER
EXPRESSION
DES
LAC-REPRESSOR-GENS
FUER
DIE
ZELLINIE
DEARCA-43
NACH
COTRANSFEKTION
VON
P3'SS
UND
POPI3P53
4.5.4.
NACHWEIS
DES
LAC-REPRESSOR-PROTEINS
MITTELS
WESTEM-BLOT
4.5.5
NACHWEIS
DER
P53-EXPRESSION
MITTELS
WESTEM-BLOT
INHALTSNNTLCHNIS
IV
5.
DISKUSSION
5.1.
SEQUENZANALYSE
DES
P53-TUMORSUPPRESSORGENS
IN
HUMANEN
NIERENZELLKARZINOMEN
5.1.1.
BEDEUTUNG
DER
ANALYTISCHEN
UND
TECHNISCHEN
VORGEHENSWEISEN
BEI
DER
SEQUENZANALYSE
DES
P53-TUMORSUPPRESSORGENS
IN
HUMANEN
NIERENZELLKARZINOMEN
51.1.1.
WAHL
DES
UNTERSUCHUNGSMATENALS
5.11.2.
EINSATZ
VON
SCREENUNG-METHODEN
ZUR
MUTATIONSANALYSE
51.1.3.
AUSDEHNUNG
DER
SEQUENZANALYSE
AUF
DIE
P53-EXONS
1
-4
UND
9-11
5.1.14.
SYNOPSIS
5.1.2.
BEDEUTUNG
DER
ERGEBNISSE
AUS
DER
SEQUENZANALYSE
DES
P53-GENS
FUER
HUMANE
NIERENZELLKARZINOME
512.1.
ABWEICHUNG
DER
P53-SEQUENZ
VON
DER
P53-VWDTYP-SEQUENZ
51
2.2.
BEDEUTUNG
DER
P53-POLYMORPHISMUS
IM
EXON
4
UND
INTRON
2
51
2.3
BEDEUTUNG
VON
MUTATIONEN
IM
P53*TUMORSUPPRESSORGEN
6
X
TRANSFEKTLON
HUMANER
NLERENZELLKARALNOME
MITTELS
ELEKTROPORATLON
5.3.
TRANSFEKTLON
HUMANER
NIERENKARZLNOMZEILEN
MIT
DEM
P53 TUMORSUPPRESSORGEN
5
31
VERWENDUNG
DES
INDUZIERBAREN
VEKTORSYSTEMS
LACSWITCHYY
5
3
2
BEDEUTUNG
DER
NACHWEISE
DER
STABILEN
TRANSFEKTLON
UND
EXPRESSION
VON
LAC-REPRESSOR
&
P53
FUER
DIE
ETABLIERUNG
INDUZIERBARER
P53-MODELLSYSTEME
5.3.3.
AUSBLICK
5.
ZUSAMMENFASSUNG
7.
LITERATURVERZEICHNIS
8.
LEBENSLAUF |
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