Untersuchung paraloger SEC61-Gene und -Proteine in Eukaryoten:
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Sprache: | German |
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1999
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Beschreibung: | Berlin, Humboldt-Univ., Diss., 1999 |
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INHALT
INHALT.
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS.III
1. ZUSAMMENFASSUNG.
2. EINLEITUNG
2.1. PROTEINTRANSLOKATIONSSYSTEME.2
2.2. PROTEINTRANSLOKATION DURCH DIE MEMBRAN DES ENDOPLASMATISCHEN
RETIKULUMS.4
2.2.1. DIE KOTRANSLATIONALE TRANSLOKATION
.
5
2.2.2. DIE POSTTRANSLATIONALE TRANSLOKATION
.9
2.2.3. KO- VERSUS POSTTRANSLATIONALER TRANSPORT
.
10
2.3. DIE KOMPONENTEN DES TRANSLOKATIONSAPPARATES.12
2.3.1. ENTWICKLUNGSGESCHICHTLICHE KONSERVIERUNG
.
12
2.3.2. DER TRIMERE SECOELP-KOMPLEX
.
12
2.3.3. DER HEPTAMERE SEC-KOMPLEX
.
15
2.4. PARALOGE SEC61-GENE IN EUKARYOTEN - PROBLEMSTELLUNG.15
3. ERGEBNISSE.
3.1. ZWEI SEC61 X-GENE IN SAEUGERZELLEN.17
3.1.1. VERGLEICH DER NUKLEINSAEURE- UND PROTEINSEQUENZEN
.
17
3.1.2. ANALYSE DER EXPRESSION BEIDER SEC61A-GENE MITTELS RT-PCR
.
21
3.2. SEC61 -PARALOGE IN DER HEFE
S.
CEREVISIAE.24
3.2.1. DAS SSHL-PROTEIN
.
24
3.2.1.1. LOKALISIERUNG DES SSHLP IN DER MEMBRAN DES ENDOPLASMATISCHEN
RETIKULUMS.24
3.2.1.2. DELETION DES SSHL-GENS.27
3.2.1.3. GENETISCHE INTERAKTION ZWISCHEN SSH1 UND SEC61.28
3.2.1.4. EINFLUSS DER SSH1 -DELETION AUF DIE AKKUMULATION VON
PRAEKURSOREN.28
3.2.2. PARALOGE BETA-UNTEREINHEITEN
.
3()
3.2.2.1. DELETION DER SBH-GCNE.3 ]
3.2.2.2. BETEILIGUNG VON SBHLP UND SBH2PAN DER PROTEINTRANSLOKATION.32
3.2.3. DER SSHLP-KOMPLEX
.
JJ
3.2.3.1. HERSTELLUNG JJEPTIDSPEZIFISCHER ANTIKOERPER GEGEN SSHLP UND
SBH2P UND IMMUNOBLOT-ANALYSE DIVERSER
DELETIONSSTAEMME.34
3.2.3.2. DER SSHLP-KOMPLEX IN WT-ZELLEN.35
3.2.3.3. AUSTAUSCHBARKEIT DER BETA-UNTEREINHEITEN.39
3.2.3.4. DER SSHLP-KOMPLEX IN DER TS-MUTANTE SEEOEL-2.41
3.2.3.5. RIBOSOMENASSOZIATION DES SSHLP-KOMPLEXES.43
4. DISKUSSION.45
4.1. DIE PARALOGEN SEC61 A-GENE IN SAEUGERZELLEN.46
4.2. DER SSH 1 P-KOMPLEX - EIN ZWEITER AKTIVER TRANSLOKATIONS-KOMPLEX IN
DER ER-MEMBRAN VON
S.
CEREVISIAE.
47
4.3. DIE ROLLE DER BETA-UNTEREINHEITEN IN DER TRANSLOKATION.51
5. MATERIAL UND METHODEN.54
5.1. ALLGEMEINE METHODEN.54
5.2. METHODEN FUER DIE RT-PCR-ANALYSE DER BEIDEN SEC61 CX-GENE IN
SAEUGERZELLEN.54
5.2.1. AUSGANGSMATERIALSSR DIE GEWINNUNG VON RNASSR DIE RT-PCRS
.
54
5.2.2. ISOLIERUNG VON RNA
.
55
5.2.3. REVERSE TRANSKRIPTION (RT)
.
56
5.2.4. PCR
.
56
5.2.5. PRIMERKOMBINATIONEN SSR RT-PCR-EXPERIMENTE
.
56
5.2.6. 3 '-RACE
.
58
5.3. METHODEN BEIM ARBEITEN MIT 5. CEREVISIAE.59
-I-
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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5.3.1. WACHSTUMSBEDINGUNGEN UND VERWENDETE MEDIEN
.
59
5.3.2. KREUZUNG, SPORULATION UND TETRADENANALYSE
.
60
5.3.2.1. KREUZUNG VON HEFESTAEMMEN.60
5.3.2.2. SPOIULATION.60
5.3.2.3. TETRADENANALYSE.60
5.3.3. TRANSFORMATION VON HEFEZELLEN MIT PLASMID-DNA
.
61
5.3.4. ISOLIERUNG GENOMISCHER DNA AUS HEFEZELLEN
.
61
5.4. KLONIERUNG UND DELETION DER GENE SSH1, SBH1 UND SBH2.62
5.4.1. KLONIERUNG DES SSHL-GENS
.
62
5.4.2. DELETION DES SSHL-GENS
.
62
5.4.3. KLONIERUNG DES SBHL-GENS
.
62
5.4.4. DELETION DES SBHL-GENS
.;.
62
5.4.5. KLONIERUNG DES SBH2-GENS
.
63
5.4.6. DELETION DES SBH2-GENS
.
63
5.4.7. EINBRINGEN DER DELETIONSKONSTRUKTE IN HEFEZELLEN
.
64
5.5. IMMUNFLUORESZENZ.64
5.5.1. EPITOP-TAGGING DES SSHL-GENS
.
64
5.5.2. ZELLEN FUER DIE IMMUNFLUORESZENZ
.
65
5.5.3. ANTIKOERPERFOER DIE IMMUNFLUORESZENZ
.
65
5.5.4. IMMUNFLUORESZENZ VON HEFEZELLEN
.
66
5.6. ANALYSE DES SSHIP-KOMPLEXES.67
5.6.1. ISOLIERUNG VON MEMBRANEN AUS HEFEZELLEN
.
67
5.6.1.1. MEMBRANPRAEPARATIONEN IN ANALYTISCHEM MASSSTAB.67
5.6.1.2. ISOLIERUNG VON HEFEMIKROSOMEN IN PRAEPARATIVEM MASSSTAB.68
5.6.2. HERSTELLUNG VON DIGITONINEXTRAKTEN AUS HEFEMIKROSOMEN
.
69
5.6.3. PRAEPARATION VON RAMP-FRAKTIONEN
.
70
5.6.4. AHTIKOERPER
.7/
5.6.5. IMMUNPRAEZIPITATIONEN
.
72
5.6.6. REINIGUNG DES SSHL-KOMPLEXES (NACH S. PANZNER)
.
72
5.7. AKKUMULATION VON PRAEKURSOR-PROTEINEN IN MUTANTEN ZELLEN.73
5.7.1. KLONIERUNG DES SSHL-GENS UNTER KONTROLLE DES GALIO-PROMOTORS
.
73
5.7.2. RADIOAKTIVE MARKIERUNG DER ZELLEN UND IMMUNPRAEZIPITATION
.
73
6. ANHANG.74
6.1. ZELLEN UND PLASMIDE.74
6.1.1. BAKTERIENSTAEMME
.
74
6.1.2. VEKTOREN
.
74
6.1.3. PLASMIDE
.
75
6.1.4. HEFESTAEMME. '.
.
79
6.2. VERGLEICH DER NUKLEOTIDSEQUENZEN DERBEIDEN SEC61 X-GENEIN
SAEUGERZELLEN.82
7. LITERATURVERZEICHNIS.88
LEBENSLAUF.96
ERKLAERUNG.97
DANKSAGUNG.97
PUBLIKATIONSLISTE.98
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