Zelluläre und molekularbiologische Grundlagen der Fibrose nach Ionenbestrahlung: Untersuchungen an Fibroblasten als In-vitro-Modell für gesundes Gewebe
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
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1999
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| Beschreibung: | Darmstadt, Techn. Univ., Diss., 1999 |
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| adam_text | ZELLULARE UND MOLEKULARBIOLOGISCHE GRUNDLAGEN DER FIBROESE C NACH
IONENBESTRAHLUNG UNTERSUCHUNGEN AN FIBROBLASTEN ALS IN VITRO-MODELL FUER
GESUNDES GEWEBE B DEM FACHBEREICH BIOLOGIE DER TECHNISCHEN UNIVERSITAET
DARMSTADT ZUR ERLANGUNG DES AKADEMISCHEN, GRADES EINES DOCTOR RERUM
NATURALIUM VORGELEGTE DISSERTATION VON CLAUDIA FOURNIER AUS
WEINHEIM/BERGSTRASSE TECHNISCHE UNIVERSITAET DARMSTADT BERICHTERSTATTER:
PROF. DR. G. KRAFT ^ ^ B ^ M OT HVK - G E MITBERICHTERSTATTER: PROF.
DR. K. NIXDORFF SCHNITTSPIHNWASSE 10 MITBERICHTERSTATTER: PROF. DR. P.
DANCKER D-6 4 2 8 7 DARMSTADT MITBERICHTERSTATTER: PROF. DR. H.P.
RODEMANN LNV.-NR. TAG DER EINREICHUNG: 12. MAI 1999 TAG DER MUENDLICHEN
PRUEFUNG: 8. JULI 1999 DARMSTADT 1999 D 17 INHALTSVERZEICHNIS 1.
ZUSAMMENFASSUNG ... 5 2. EINLEITUNG 7 2.1. PHYSIKALISCHE EIGENSCHAFTEN
VON STRAHLUNG 7 2.2. FIBROBLASTEN UND EXTRAZELLULAERE MATRIX (ECM) 9
2.2.1. AUFBAU UND FUNKTION DER EXTRAZELLULAEREN MATRIX (ECM) 9 2.2.2: DAS
FIBROBLASTEN/FIBROZYTEN-ZELLSYSTEM . . 10 2.3. STRAHLENBIOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGEN IN VITRO 12 2.3.1. ZELLZYKLUS-VERZOEGERUNG NACH
BESTRAHLUNG * 13 2.3.2. ZELLINAKTIVIERUNG 13 2.3.3. INAKTIVIERUNG NACH
FRAKTIONIERTER-BESTRAHLUNG 15 2.3.4. BIOLOGISCHE WIRKUNG VON
HOCH-LET-BESTRAHLUNG 15 2.3.5. DIE RELATIVE BIOLOGISCHE WIRKSAMKEIT
. ... 17 2.4. FIBROESE - EIN HAEUFIGER SPAETSCHADEN NACH BESTRAHLUNG 19
2.4.1. KLINISCHE MANIFESTATION DER FIBROESE 20 2.4.2. FIBROESE ALS FOLGE
DER INTERAKTION VERSCHIEDENER ZELLSYSTEME .. 21 2.4.3. DER MOLEKULARE
MECHANISMUS VON FIBROESE: DIE BESONDERE ROLLE VON TGFSS .-..-.; 22 2.4.4.
INDUKTION DES ZELLZYKLUS-ARRESTES DURCH TGFSS 24 2.5. TUMORTHERAPIE MIT
SCHWEREN IONEN 26 * * Z 1 - . * * 3. PROBLEMSTELLUNG 29 4. MATERIAL
UND METHODEN ........ ^ 31 4.1. MATERIAL ... . : . . . . . . . . . . 31
; 4.1.1. ZEIL-LINIEN . . . . : . . . . . . .-. . .- 31 4.1.1.1.
FIBROBLASTEN 31 4.1.1.2. HELA-ZELLEN ............:... 32 4.2. METHODEN
... ......,..:... ;....... 32 4.2.1. -STERILISATION . . 32 4.2.1;
ZELLKULTUR . . . . . . -. ....... 32 4.2.2.1.
KULTIVIERUNGSBEDINGUNGEN .....:.....-. 32 4.2.2.2. SUBKULTIVIERUNG DER
MONOLAEYER-KULTUREN 32 4.2.2.3. LAHGZEITLAGERUNG DER ZELLEN *. 34
4.2.2.4. ETABLIERUNG VON PRIMAERKULTUREN AUS EXPLANTATEN ... 34 4.2.2.5.
BESTIMMUNG DER WACHSTUMSKINETIK 35 4.2.2.6. BESTIMMUNG DER
KOLONIEBILDUNGSFAEHIGKEIT . 35 4.2.2.7. MYKOPLASMENTEST . 36 4.2.2.8.
SERUMTEST . 36 4.2.3. BESTRAHLUNGSEXPERIMENTE 37 4.2.3.1.
BESTRAHLUNGSEINRICHTUNGEN UND DOSIMETRIE 37 4.2.3.2. BESTRAHLUNG DER
ZELLEN MIT ROENTGENSTRAHLEN 38 4.2/3.3. BESTRAHLUNG DER ZELLEN MIT
SCHWERIONENSTRAHLEN .... 38 4.2.4. INAKTIVIERUNG UND BESTIMMUNG DER
RELATIVEN BIOLOGISCHEN WIRKSAMKEIT . . . /. . . . . . .... . . 40
4.2.5. BESTIMMUNG DES FRAKTIONIERUNGSEFFEKTS BEI ZELLUEBERLEBEN ... 42
INHALTSVERZEICHNIS 4.2.6. DURCHFLUSSZYTOMETRIE (ZYKLUSPHASEN-VERTEILUNG)
43 4.2.7. CHROMOSOMENPRAEPARATION UND FAERBUNG ....... ...... 44 -*
4.2.7.1. CHROMOSOMENPRAEPARATION 44 4.2.7.2. FAERBUNG MIT GIEMSA 44
4.2.7.3. G-BANDING . . , .45 4.2.8. PREMATURE CHROMOSOME CONDENSATION
(PCC-TECHNIK) 45 4.2.9. BESTIMMUNG DES DIFFERENZIERUNGSMUSTERS DER
FIBROBLASTEN ... 46 4.2.10. BESTIMMUNG DER KOLLAGEN- UND
GESAMTPROTEINSYNTHESE .... 47 4.2.11. ELISA ZUR BESTIMMUNG DER TGFSS
1-PROTEINMENGE . 48 4.2.12. IMMUN-NEUTRALISATION VON TGFSS 49 4.2.13.
COKULTUR VON BESTRAHLTEN UND UNBESTRAHLTEN FIBROBLASTEN .... 50 4.2.14.
NORTHERNBLOT ZUM NACHWEIS VON TGFSS-MRNA (FIBROBLASTEN) ;,.,...... . *.
SO 4.2.15. WESTERNBLOT ZUM NACHWEIS VON P21 (FIBROBLASTEN) 52 5.
ERGEBNISSE 54 5.1. CHARAKTERISIERUNG DER VERWENDETEN ZEIL-LINIEN 54
5.1.1., MYKOPLASMEN-INFEKTION 55 5.1.2. KARYOGRAMM DER AG-ZELLEN 55
5.1.3. NACHWEIS VON CHROMOSOMENABERRATIONEN 57 5.1.4. WACHSTUMSKINETIK
.-,*** 57 5.1.5. KOLONIEBILDUNGSFAEHIGKEIT IN ABHAENGIGKEIT VON DER
ZELLDICHTE . 58 5.1.6. KOLONIEBILDUNGSFAEHIGKEIT IM LANGZEITVERSUCH .-. .
... 59 5.1.7. DIFFERENZIERUNGSMUSTER IM LANGZEITVERSUCH 60 5.2.
ZELLUEBERLEBEN NACH BESTRAHLUNG *****, *.,.... 62 5.2.1. ZELLUEBERLEBEN
NACH ROENTGENBESTRAHLUNG 62 5.2.2. VERGLEICH ZWISCHEN PROLIFERIERENDEN
UND KONTAKTINHIBIERTEN KULTUREN 64 5.2.3. RELATIVE BIOLOGISCHE
WIRKSAMKEIT UND WIRKUNGSQUERSCHNITT . . 65 5.2.4. ZELLUEBERLEBEN NACH
FRAKTIONIERTER BESTRAHLUNG ..........;. 71 5.2.5. BESTRAHLUNG IN EINEM
AUSGEDEHNTEN BRAGG-PEAK ...,.* 78 5.3.1. VERAENDERUNGEN DES
DIFFERENZIERUNGSMUSTERS NACH BESTRAHLUNG 80 * 5.3.1. AENDERUNGEN DES
DIFFERENZIERUNGSMUSTERS IN ABHAENGIGKEIT VON DER STRAHLENQUALITAET 82
5.3.2- VERAENDERUNG DES DIFFERENZIERUNGSMUSTERS NACH FRAKTIONIERTER
BESTRAHLUNG 84 5.3.3. DIFFERENZIERUNGSMUSTER VON UNBESTRAHLTEN
FIBROBLASTEN IN COKULTUR MIT BESTRAHLTEN FIBROBLASTEN 85 5.4.
STRAHLENINDUZIERTE AENDERUNG DER KOLLAGEN-PRODUKTION BEI FIBROBLASTEN 86
5.4.1. KOLLAGEN-PRODUKTION NACH BESTRAHLUNG MIT STRAHLENARTEN
VERSCHIEDENER QUALITAET 87 5.4.2. KOLLAGEN-PRODUKTION IM IN
VIYRO-LANGZEITVERSUCH 90 5.4.3. KOLLAGEN-PRODUKTION NACH FRAKTIONIERTER
BESTRAHLUNG 91 5.5. PRODUKTION UND SEKRETION VON TGFSS . .,. . . K 92
5.5.1. ABHAENGIGKEIT VON DER ZELLKONZENTRATION . . . 93 5.5.2.
ABHAENGIGKEIT VON DER ZELLZYKLUS-PHASE . . 94 INHALTSVERZEICHNIS 5.5.3.
ABHAENGIGKEIT VOM SERUMGEHALT DES KULTURMEDIUMS 96 5.5.4. TGFSS-PRODUKTION
UND -SEKRETION NACH ROENTGENBESTRAHLUNG . 100 5.5.5. TGFSS-PRODUKTION UND
-SEKRETION NACH 195 MEV/U C-IONEN- BESTRAHLUNG . . . .....:..... 101
5.5.6. TGFSS-PRODUKTION UND -SEKRETION NACH 11,0 MEV/U C-IONEN-
BESTRAHLUNG . . * ... . . ,. 101 5.5.7. TGFSS-PRODUKTION UND -SEKRETION
IM IN V/FRO-LANGZEITVERSUCH :.;.... ~: 102 5.6. GENEXPRESSION VON TGFSS
NACH C-IONEN-BESTRAHLUNG 103 5.7. IMMUN-NEUTRALISATION VON TGFSS : . 104
5.7.1. CHROMOSOMEN-ANALYSE MITTELS PCC NACH IMMUN-NEUTRALISATION VON
TGFSS .,, * . . . ........ 107 5.8. UNTERSUCHUNGEN MIT FIBROBLASTEN DER
SCHWEINEHAUT 109 5.8.1. UEBERLEBENSEXPERIMENTE NACH IN VZVRO-BESTRAHLUNG
VON PSL-ZELLEN .... 110 5.8.2. VERGLEICH DER PROTEIN-PRODUKTION NACH IN
VITRO- UND NACH IN VIVO- BESTRAHLUNG ........ ^ ...:.:. 112 5.8.3.
AENDERUNG DES DIFFERENZIERUNGSMUSTERS NACH BESTRAHLUNG ... 115 5.9.
EXPRESSION DES ZELLZYKLUS-REGULATORPROETEINS P21 NACH BESTRAHLUNG . 116
5.10. EINFLUSS DES FOETALEN KAELBERSERUMS AUF DAS DIFFERENZIERUNGSMUSTER
UND AUF DIE PRODUKTION VON KOLLAGEN UND TGFSS. 119 5.10.1. EINFLUSS AUF
DIE ENTWICKLUNG DER ZELLZAHL NACH BESTRAHLUNG . 121 5.10.2. ABHAENGIGKEIT
DES DIFFERENZIERUNGSMUSTERS VON FOETALEM KAELBERSERUM , 123 5.10.3.
ABHAENGIGKEIT DER KOLLAGENPRODUKTION VON FOETALEM KAELBERSERUM ., 125
5.10.4. ABHAENGIGKEIT DER TGFSS-PRODUKTION VON FOETALEM KAELBERSERUM /. .
128 5.10.5. ZUSAMMENFASSUNG 130 6. DISKUSSION 131 6.1. GRUNDLAGEN DER
UNTERSUCHUNGEN 131 6.1.1. CHARAKTERISIERUNG DER ZEIL-LINIEN . 131 6.2.
RELATIVE BIOLOGISCHE WIRKSAMKEIT UND FRAKTIONIERUNGSEFFEKTE BEI
BESTRAHLUNG MIT C-IONEN- 134 6.2.1. STRAHLENARTEN 134 6.2.2.
ZELLUEBERLEBEN NACH ROENTGENBESTRAHLUNG 135 6.2.3. RELATIVE BIOLOGISCHE
WIRKSAMKEIT VON KOHLENSTOFF- UND NICKEL- IONEN-STRAHLUNG . 137 6.2.4.
FRAKTIONIERUNGSEFFEKTE 142 6.2.5. BESTRAHLUNG IN EINEM AUSGEDEHNTEN
BRAGG-PEAK 143 6.2.6. ZUSAMMENFASSUNG 144 6.3. STRAHLENINDUZIERTE
AENDERUNGEN DES DIFFERENZIERUNGSMUSTERS VON HUMANEN FIBROBLASTEN
(AG-ZELLEN) 145 6.4. STRAHLENINDUZIERTE STEIGERUNG DER
ECM-PROTEINPRODUKTION BEI HUMANEN FIBROBLASTEN 147 6.5.
STRAHLENINDUZIERTE AENDERUNG DES DIFFERENZIERUNGSMUSTERS UND DER
INHALTSVERZEICHNIS MATRIXPROTEIN-PRODUKTION BEI FIBROBLASTEN DER
SCHWEINEHAUT 150 6.6. TGFSS ALS MEDIATOR DER STRAHLENINDUZIERTEN
TERMINALEN DIFFERENZIERUNG . . 152 6.6.1. IMMUN-NEUTRALISATION VON TGFSS
155 6.6.2: EINFLUSS VON FOETALEM KAELBERSERUM AUF DAS
DIFFERENZIERUNGSMUSTER, DIE SYNTHESE VON MATRIXPROTEINEN UND DIE
TGFSS-PRODUKTION VON FIBROBLASTEN . . . , 156 6.6.3. EXPRESSION DES
ZELLZYKLUS-REGULATORPROTEINS P21 158 6.6.4. ZUSAMMENFASSUNG 160 6.7.
AUSBLICK 161 LITERATURVERZEICHNIS 162 ANHANG A 176 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
176 ANHANG B 177 MATERIALIEN 177 B.L. MEDIEN UND SEREN FUER DIE
ZELLKULTUR 177 B.2. CHEMIKALIEN . 178 B.3. LOESUNGEN UND PUFFER 180 B.4.
ANTIKOERPER UND ENZYME . 184 B.5. NUKLEOTIDE UND NUKLEINSAEUREN 185 B.6.
EINWEGMATERIAL UND GERAETE 185
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