Glykoprotein E2 des Virus der Bovinen Virusdiarrhoe (BVDV): Expression und Immunisierung mit rekombinanten Sindbis-Virus-Vektoren
Gespeichert in:
1. Verfasser: | |
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1999
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INHALTSVERZEICHNIS
I
1.
EINLEITUNG
1
2.
SCHRIFTTUM
2
2.1.
DAS
VIRUS
DER
BOVINEN
VIRUSDIARRHOE
2
2.1.1.
KLASSIFIZIERUNG,
AUFBAU
UND
IMMUNOLOGIE
2
2.1.2.
DAS
GLYKOPROTEIN
E2
DER
PESTIVIREN
8
2.2.
EXPRESSION
UND
IMMUNISIERUNG
MIT
VIRALEN
VEKTOREN
13
2.2.1.
VIRALE
EXPRESSIONS
VEKTOREN
UND
IHR
EINSATZ
ZUR
VAKZINIERUNG
IN
DER
TIERMEDIZIN
13
2.2.2.
DAS
SINDBIS-VIRUS-EXPRESSIONSSYSTEM
18
3.
MATERIAL
UND
METHODEN
26
3.1.
ZELLKULTUR
26
3.1.1.
BOVINE
EMBRYONALE
LUNGENFIBROBLASTEN
(BEL)
26
3.1.2.
BABY
HAMSTER
KIDNEY-ZELLEN
(BHK-21)
26
3.1.3.
L929-ZELLEN
26
3.1.4.
P815-ZELLEN
27
3.1.5.
RABBIT
KIDNEY
ZELLEN
(RKJS)
27
3.2.
BVD-VIRUSSTAENUNE
27
3.3.
PLASMIDE
28
3.3.1.
VEKTORPLASMIDE
28
3.3.2.
HELFERPLASMIDE
29
3.4.
AMPLIFIKATION
DES
BVDV-E2-GENS
31
3.4.1.
ISOLIERUNG
VIRALER
RNS
31
3.4.2.
AUSWAHL
E2-SPEZIFISCHER
PRIMER
31
3.4.3.
REVERSE
TRANSKRIPTION
(RT)
UND
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
33
3.5.
KLONIERUNG
DER
BVDV-E2-AMPLIFIKATE
IN
SINDBIS-VEKTOREN
34
3.5.1.
AGAROSEGEL-AUFREINIGUNG
UND
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEVERDAU
34
3.5.2.
LIGATION
DER
VEKTOR
UND
INSERT-DNS
35
3.5.3.
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
BAKTERIEN
35
3.5.4.
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNS
(YYPLASMIDSCHNELLTEST
"
)
35
3.5.5.
DNS-MESSUNG
36
INHALTSVERZEICHNIS
N
3.5.6.
DNS-SEQUENZIERUNG
36
3.6.
HERSTELLUNG
VON
REKOMBINANTEN
SINDBIS-VIREN
UND
PSEUDO
VIRIONEN
36
3.6.1.
AUFREINIGUNG
UND
LINEARISIERUNG
VON
PLASMID-DNS
36
3.6.2.
IN
VIFRO-TRANSKRIPTION
37
3.6.3.
TRANSFEKTION
VON
BHK-ZELLEN
DURCH
ELEKTROPORATION
38
3.6.4.
VERMEHRUNG
REKOMBINANTER
SINDBIS-VIREN
38
3.6.5.
TITRATION
DER
REKOMBINANTEN
SINDBIS-VIREN
UND
PSEUDOVIRIONEN
39
3.7.
ANALYSE
DER
PROTEINEXPRESSION
39
3.7.1.
MONOKLONALE
ANTIKOERPER
UND
SEREN
39
3.7.2.
INDIREKTE
IMMUNFLUORESZENZFAERBUNG
(IF)
IM
DURCHFLUSSZYTOMETER
41
3.7.2.I.
IF-FAERBUNG
INTRAZELLULAERER
ANTIGENE
41
3.7.2.2.
IF-FAERBUNG
VON
OBERFLAECHENANTIGENEN
41
3.7.2.3.
ANALYSE UND
AUSWERTUNG
IM
DURCHFLUSSZYTOMETER
41
3.7.3.
INDIREKTE
IMMUNFLUORESZENZMIKROSKOPIE
42
3.7.4.
IMMUNOBLOT
43
3.7.4.I.
VORBEREITUNG
DER
PROBEN
43
3.7.4.2.
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
43
3.7.4.3.
ELEKTROTRANSFER
UND
IMMUNODETEKTION
43
3.7.4.4.
DETEKTION
BIOTIN-MARKIERTER
PROTEINE
44
3.7.4.5.
X-GAL-FAERBUNG
LACZ-EXPRIMIERENDERZELLEN
45
3.8.
TIERVERSUCHE
46
3.8.1.
TIERGRUPPEN
46
3.8.2.
IMMUNISIERUNG
46
3.8.3.
PROBENENTNAHME,
BEARBEITUNG
UND
LAGERUNG
48
3.8.3.1.
BLUTENTNAHME
48
3.8.3.2.
MILZENTNAHME
UND
LYMPHOZYTENGEWINNUNG
48
3.9.
TESTSYSTEME
49
3.9.1.
SERUMNEUTRALISATIONSTEST
(SNT)
49
3.9.2.
LYMPHOZYTENTRANSFORMATIONSTEST
49
3.9.3.
IMMUNENZYMATISCHER
NACHWEIS
(ELISA)
VON
BVDV-E2
ODER
E2-SPEZIFISCHER
ANTIKOERPER
52
INHALTSVERZEICHNIS
IN
4.
ERGEBNISSE
53
4.1.
SEQUENZANALYSE
DES
E2-GENS
DER
BVDV-ISOLATE
UND
-KLONE
53
4.1.1.
VIRUSKLONIERUNG
53
4.1.2.
SEQUENZIERUNG
UND
HOMOLOGIEVERGLEICH
53
4.2.
KONSTRUKTION
BVDV-E2-REKOMBINANTER
SINDBIS-VIREN
UND
PSEUDOVIRIONEN
57
4.2.1.
REVERSE
TRANSKRIPTION
UND
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(RT-PCR)
ZUR
AMPLIFIKATION
DES
E2-GENS
57
4.2.2.
KLONIERUNG
DES
E2-GENS
IN
DIE
SINDBIS-VEKTOREN
UND
IN
VIWO-TRANS
KRIPTION
DER
REKOMBINANTEN
VEKTOR-DNS
IN
RNS
59
4.2.3.
CHARAKTERISIERUNG
DER
PROTEIN-EXPRESSION
NACH
TRANSFEKTION
MIT
REKOM
BINANTER
SINDBIS-REPLIKON-RNS
UND
KOTRANSFEKTION
MIT
SINDBIS-HELFER
RNS
63
4.3.
BVDV-E2-REKOMBINANTE
SINDBIS-VIREN
UND
PSEUDOVIRIONEN
66
4.3.1.
HERSTELLUNG
UND
TITERBESTIMMUNG
REKOMBINANTER
SINDBIS-VIREN
UND
PSEUDOVIRIONEN
66
4.3.2.
NACHWEIS
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
E2-EXPRESSION
DURCH
REKOMBINANTE
SINDBIS-VIREN
UND
PSEUDOVIRIONEN
69
4.3.2.1.
INDIREKTE
IMMUNFLUORESZENZ
(FACS-ANALYSE
UND
IF-MIKROSKOPIE)
69
4.3.2.2.DETEKTION
VON
REKOMBINANTEM
E2
IM
IMMUNOBLOT
81
4.3.2.3.DETEKTION
VON
REKOMBINANTEM
E2
NACH
IMMUNPRAEZIPITATION
85
4.3.2.4.NACHWEIS
VON
SINDBIS-VIRUS-EXPRIMIERTEM
BVDV-E2
IM
ELISA
87
4.4.
CHARAKTERISIERUNG
BVDV-E2-REKOMBINANTER
SINDBIS-VIREN
UND
PSEUDOVIRIONEN
IM
TIERVERSUCH
89
4.4.1.
IMMUNISIERUNG
VON
MAEUSEN
89
4.4.2.
IMMUNISIERUNG
VON
KANINCHEN
93
5.
DISKUSSION
102
5.1.
E2-GEN
DER
AUSGEWAEHLTEN
BVDV-STAEMME
5.2.
EXPRESSION
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
BVDV-E2
BEIDER
102
INHALTSVERZEICHNIS
IV
GENOTYPEN
IM
SINDBIS-VIRUS-VEKTORSYSTEM
103
5.3.
CHARAKTERISIERUNG
BVDV-E2-REKOMBINANTER
SINDBIS-VIREN
UND
PSEUDOVIRIONEN
IM
TIERVERSUCH
109
5.3.1.
IMMUNISIERUNG
VON
MAEUSEN
109
5.3.2.
IMMUNISIERUNG
VON
KANINCHEN
112
6.
ZUSAMMENFASSUNG/
SUMMARY
116
7.
LITERATUR
118
8.
ANHANG
141
8.1.
GERAETE
UND
LABORHILFSMITTEL
141
8.2.
VERZEICHNIS
DER
VERWENDETEN
ABKUERZUNGEN
149 |
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