Ein nichtvirales Vektorsystem für die Gentherapie: verstärkte und ortsspezifische Integration von Plasmid-DNA vermittelt durch das Rep-Protein des Adeno-assoziierten Virus
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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| Veröffentlicht: |
1999
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INHALTSVERZEICHNIS
V
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
.
V
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
.
XI
1.
ZUSAMMENFASSUNG
.
1
2.
EINLEITUNG
.
3
2.1.
GENTHERAPIE
ALS
MEDIZINISCHE
ANWENDUNG
DER
GENTECHNOLOGIE
.
3
2.2
ZIELE
UND
STRATEGIEN
DER
GENTHERAPIE
.
4
2.2.1.
WIEDERHERSTELLUNG
ZELLULAERER
FUNKTIONEN
DURCH
GENTHERAPIE
.
4
2.2.2
GEZIELTE
ZERSTOERUNG
VON
ZELLEN
DURCH
GENTHERAPIE
.
5
2.2.3
PRAEVENTIVER
EINSATZ
GENTHERAPEUTISCHER
VERFAHREN
.
6
2.3
VEKTOREN
ZUM
GENTRANSFER.
.
6
2.3.1
RETROVIRALE
GENTRANSFERVEKTOREN
.
8
2.3.2
ADENOVIRALE
GENTRANSFERVEKTOREN
.
10
2.3.3
DAS
ADENO-ASSOZIIERTE
VIRUS
(AAV)
UND
ABGELEITETE
GENTRANSFERVEKTOREN
.
13
2.3.3.1
LEBENSZYKLUS
DES
AAV
.
14
2.3.3.2
DIE
GENOMSTRUKTUR
DES
AAV
.
15
2.3.3.3
REPLIKATION
DES
AAV-GENOMS
.
16
2.3.3.4
DIE
INVERTIERTEN
TERMINALEN
REPETITIONEN
(ITRS)
DES
AAV
.
18
2.3.3.5
REPLIKATIONS-PROTEINE
(REP)
DES
AAV
.
19
2.3.3.6
REGULATION
DER
GENEXPRESSION
.
20
2.3.37
ORTSSPEZIFISCHE
INTEGRATION
DES
AAV
.
20
2.3.3.8
HERSTELLUNG
REKOMBINANTER
AAV-GENTRANSFERVEKTOREN
.
21
2.3.3.9
REKOMBINANTE
AAV-VEKTOREN
IN
DER GENTHERAPIE
.
24
2.3.4
ANDERE
VIRALE
GENTRANSFERVEKTOREN
.
24
2.3.5
NICHTVIRALE
VEKTORSYSTEME
FUER
DEN
GENTRANSFER
.
26
2.3.5.1
PHYSKALISCHE
GENTRANSFERSYSTEME
.
26
2.3.5.2
BIOLOGISCH-CHEMISCHE
GENTRANSFERSYSTEME
.
27
2.3.5.3
PLASMIDE
MIT
ELEMENTEN
DES
AAV
.
28
2.4
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
.
30
3.
MATERIAL
.
31
3.1
EUKARYONTENZELLINLEN
.
31
3.2
BAKTERIENSTAEMME
.
31
VI
INHALTSVERZEICHNIS
3.3
VIREN
.
31
3.4
ANTIKOERPER
.
31
3.5
ENZYME
.
32
3.6
OLIGONUKLEOTIDE
FUER
PCR
UND
SEQUENZIERUNGEN
.
32
3.7
PLASMIDE
UND
NUKLEINSAEUREN
.
33
3.8
MEDIEN
UND
ZUSAETZE
.
34
3.9
CHEMIKALIEN
UND
VERBRAUCHSMATERIAL
.
34
4.
METHODEN
.
37
4.1
HANDHABUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
37
4.1.1
PHENOLEXTRAKTION
.
37
4.1.2
ETHANOLPRAEZIPITATION
.
37
4.1.3
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
.
38
4.2
ISOLIERUNG
VON
DNA.
38
4.2.1
PRAEPARATION
VON
PLASMIDEN
IM
KLEINEN
MASSSTAB
(
'
MINI-PRAEPARATION
'
)
.
38
4.2.2
PRAEPARATION
VON
PLASMIDEN
IM
KLEINEN
MASSSTAB
UEBER
LONENAUSTAUSCHERSAEULCHEN
.
39
4.2.3
PLASMIDPRAEPARATION
UEBER
LONENAUSTAUSCHERSAEULEN
.
39
4.2.4
PLASMIDPRAEPARATION
UEBER
CAESIUMCHLORID-GRADIENTEN
.
40
4.2.5
EXTRAKTION
VON
EXTRACHROMOSOMALER
DNA
AUS
EUKARYONTENZELLEN
.
40
4.2.6
EXTRAKTION
VON
CHROMOSOMALER
DNA
AUS
EUKARYONTENZELLEN
.
41
4.3
ELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
41
4.4
NACHWEIS
SPEZIFISCHER
NUKLEINSAEUREN
.
42
4.4.1
DNA-TRANSFER
AUF
NYLONMEMBRANEN
(SOUTHERN-B/OF)
.
42
4.4.2
MARKIERUNG
VON
DNA
DURCH
RANDOM
PRINWNG-SYNTHESE.
43
4.4.3
DNA-DNA
HYBRIDISIERUNG
MIT
EINER
MARKIERTEN
SONDE
.
44
4.5
REKOMBINATION
VON
DNA
.
45
4.5.1
AMPLIFIKATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
MITTELS
POLYMERASE-KETTENREAKTION.
45
4.5.2
SPALTUNG
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
46
4.5.3
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
.
46
4.5.3.1
ABTRENNUNG
DER
AGAROSE
DURCH
EINE
SIEBSAEULE
(SPINX)
.
46
4.5.3
2
AFFINITAETSREINIGUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSE
(QIAQUICK)
.
47
4.5.4
MODIFIKATION
VON
DNA-ENDEN
.
47
4.5.4.1
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
5
'
-DNA-ENDEN
.
47
4.5.4.2
AUFFUELLEN
VON
5'-UEBERHAENGENDEN
ENDEN
.
48
4.5.4.3
ENTFERNEN
VON
5
'-UEBERHAENGENDEN
ENDEN
.
48
4.5.4.4
GLAETTEN
VON
3
'-UEBERHAENGENDEN
ENDEN
.
49
4.5.4.5
PHOSPHORYLIERUNG
VON
5'-DNA-ENDEN
.
49
4.5.4.6
ADDITION
VON
LINKERMOLEKUELEN
AN
DNA
.
49
4.5.5
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
50
4.5.6
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
BAKTERIEN
.
50
INHALTSVERZEICHNIS
VII
4.5.7
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
BAKTERIEN
.
51
4.6
SEQUENZIERUNG
VON
PLASMLD-DNA
.
.
51
4.6.1
SEQUENZIERREAKTION
.
52
4.6.2
DENATURIERENDE
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
.
53
4.7
HERSTELLUNG
SYNTHETISCHER
OLIGONUKLEOTIDE
.
53
4.8
UMGANG
MIT
EUKARYONTEN
ZELLKULTUREN
.
54
4.8.1
KULTIVIERUNG
.
54
4.8.2
TRANSFEKTION
MITTELS
LIPOFECTIN
.
55
4.8.3
NACHWEIS
DER
TRANSFEKTIONSEFFIZIENZ
.
55
4.8.4
SELEKTION
G418-RESISTENTER
ZELLEN
.
55
4.9
UMGANG
MIT
VIREN
.
56
4.9.1
HERSTELLUNG
VON
ADENO
WUS-VIRUSSTOCKS
.
56
4.9.2
VIRUSTITERBESTIMMUNG
VON
ADENOVIREN
.
56
4.9.3
REPLIKATIONSTEST
VON
AAV
ODER
ITR-PLASMIDEN
.
57
4.9.4
MOBILISIERUNG
VON
RAAV-PROVIRUS
.
57
4.9.5
INFEKTION
VON
HELA-ZELLEN
MIT
RAAV
.
57
4.10
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
.
58
4.10.1
PROTEINEXTRAKTION
AUS
EUKARYONTEN
ZELLEN
.
58
4.10.2
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
.
58
4.10.3
NACHWEIS
VON
PROTEIN-SYNTHESE
.
59
4.10.3.1
NACHWEIS
DER
SS-GALAKTOSIDASE
IN
SITU
.
59
4.10.3.2
LUMINESZENZ-NACHWEIS
DER
SS-GALAKTOSIDASE
.
60
4.10.3.3
LUMINESZENZ-NACHWEIS
DER
LUZIFERASE
.
60
4.10.3.4
LUMINESZENZ-NACHWEIS
DER
ALKALISCHEN
PHOSPHATASE
.
61
4.10.3.5
AUTOFLUORESZENZ
DES
GRUEN-FLUORESZIERENDEN
PROTEINS
.
62
4.10.4
GLYCIN-SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
.
62
4.10.5
WESTEMBLOT
.
63
4.10.5.1
ELEKTROTRANSFER
VON
PROTEINEN
.
63
4.10.5.2
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
(WESTEMBLOF)
.
64
5.
ERGEBNISSE
.
66
5.1
GRUNDLAGEN
DER
ARBEIT
.
66
5.2
AAV-PROVIRUS-PLASMIDE
.
67
5.2.1
KONSTRUKTION
DES
PROVIRUS-PLASMIDS
PAAV
.
67
5.2.2
NACHWEIS
DER FUNKTIONALITAET
DER
ITRS
IN
PAAV
.
68
5.3
SEKUNDAERSTRUKTUR
DER
ITRS
IN
PLASMID-DNA
.
71
5.3.1
HINWEISE
AUF
DIE
STRUKTUR
DER
ITRS
DURCH
RESTRIKTIONSENZYM-VERDAU
.
71
5.3.2
DARSTELLUNG
VON
AAV-PLASMIDEN
DURCH
PHYSIKALISCHE
MIKROSKOPIE
.
73
5.3.3
VERBESSERUNG
DER
AUFLOESUNG
DES
HSTM
BEI
DNA-PRAEPARATEN
.
75
5.4
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
PERSISTENZ
VON
PLASMIDEN
MIT
ITRS
NACH
TRANSFEKTION
HUMANER
ZELLEN
IN
ABWESENHEIT
DER
AAV-REP-PROTEINE
.
76
5.4.1
KONSTRUKTION
VON
MARKERGEN-PLASMIDEN
MIT
DEN
ITRS
DES
AAV
.
76
VIII
INHALTSVERZEICHNIS
5.4.2
UEBERPRUEFUNG
DER
FUNKTIONALITAET
DER
ITRS
IN
DEN
ITR-PLASMIDEN
.
78
5.4.3
TRANSIENTE
EXPRESSION
VON
ZIRKULAEREN
ITR-PLASMIDEN
.
80
5.4.4
KEINE
ERHOEHTEN
INTEGRATIONSRATEN
VON
ZIRKULAEREN
ITR-PLASMIDEN
.
82
5.4.5
TRANSDUKTIONSKOMPETENZ
VON
AUS
ZELLKLONEN
MIT
PITR-NEO-INTEGRATEN
MOBILISIERTEN
REKOMBINANTEN
AAV
.
84
5.4.6
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
PERSISTENZ
LINEARER ITR-FLANKIERTER
DNA
.
85
5.4.6.1
TRANSIENTER
VERLAUF
DER
EXPRESSION
VON
LINEARER,
ITR-FLANKIERTER
DNA:
TFR-/ACZ-ITR'
.
86
5.4.6.2
INTEGRATIONSRATEN
VON
LINEARER
ITR-FLANKIERTER
DNA:
'
ITR-NEO-ITR
'
.
87
5.4.6.3
INTEGRATIONSRATEN
VON
DENATURIERTER
ZIRKULAERER
UND
LINEARER
DNA
MIT
DEN
ITRS
DES
AAV:
PITR-NEO
UND
'
ITR-NEO-ITR
'
.
87
5.5
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
EIGNUNG
VON
ITR-PLASMIDEN
ALS
NICHTVIRALE
VEKTOREN
BEI
TRANSIENTER
SYNTHESE
VON
REP
.
89
5.5.1
KEINE
ERHOEHTEN
INTEGRATIONSRATEN
VON
ITR-PLASMIDEN
BEI
ANWESENHEIT
EINES
VERPACKUNGSPLASMID
.
89
5.5.2
ITR-PLASMIDE
MIT
REP78/52-GEN
IN
CIS
.
90
5.5.2.1
KONSTRUKTION
VON
ITR-PLASMIDEN
MIT
REP78/52-GEN
IN
CIS
.
91
5.5.2.1.1
KONSTRUKTION
VON
HGFP-NEO-PLASMIDEN
MIT
REP78/52-GEN
IN
CIS.
.92
5.5.2.1.2
KONSTRUKTION
EINES
FUSIONSGENS
AUS
HGFP
UND
NEO
.
93
5.5.2.1.3
NACHWEIS
DER
SYNTHESE
DER
REP-PROTEINE
.
94
5.5.2.1.4
NACHWEIS
DER
FUNKTION
DER
ITRS
UND
DER
REP-PROTEINE
.
96
5.5.2.2
ERHOEHTE
INTEGRATIONSRATEN
BEI
PLASMIDEN
MITREP-GEN
IN
CIS
.
98
5.5.2.3
ERHOEHTE
INTEGRATIONSRATEN
VON
PLASMID-DNA
DURCH
REP-PROTEINE
IN
TRANS
.
100
5.5.2.4
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
BEITRAG
DER
REP-BINDUNGSSTELLEN
(RBS)
BEI
DER
DURCH
REP
VERMITTELTEN
INTEGRATION
.
102
5.5.2.4.1
IDENTIFIZIERUNG
EINER
ALTERNATIVEN
REP-BINDUNGSSTELLE
IN
PHGFPNEO
.
102
5.5.2.4.2
DELETION
EINER
ALTERNATIVEN
REP-BINDUNGSSTELLE
IN
PHGFPNEO.
103
5.5.2.4.3
ERHOEHTE
INTEGRATIONSRATEN
VON
PLASMIDEN
MIT
REP-
BINDUNGSSTELLEN
IN
ANWESENHEIT
VON
REP-PROTEINEN
.
105
5.6
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
SPEZIFITAET
DER
INTEGRATION
VON
PLASMID-DNA
MIT
ELEMENTEN
DES
AAV
.
106
5.6.1
KEINE
SEQUENZ-SPEZIFISCHE
INTEGRATION
VON
ITR-PLASMIDEN
OHNE
REP78/52-GEN
.
107
5.6.2
SEQUENZ-SPEZIFISCHE
INTEGRATION
VON
ITR-PLASMIDEN
MIT
REP78Z52-GEN
.
108
5.6.3
SEQUENZ-SPEZIFISCHE
INTEGRATION
VON
PLASMIDEN
MIT
REP78/52-GEN,
DIE
KEINE
ITRS
ENTHALTEN
.
110
6.
DISKUSSION
.
113
6.1
STRUKTUR
VON
PLASMID-DNA
MIT
DEN
ITRS
VON
AAV
.
114
6.2
DIE
PERSISTENZ
VON
PLASMIDEN
WIRD
DURCH
DIE
ITRS
VON
AAV
IN
ABWESENHEIT
VON
REP-PROTEINEN
NICHT
VERLAENGERT
.
116
6.3
LINEARE
DNA
MIT
FLANKIERENDEN
ITRS
ZEIGT
IN
ABWESENHEIT
VON
REP-
PROTEINEN
WEDER
VERLAENGERTE
EXPRESSION,
NOCH
GEHAEUFTE
INTEGRATION
.121
INHALTSVERZEICHNIS
IX
6.4
DIE
REP-PROTEINE
DES
AAV
STEIGERN
DIE
INTEGRATIONSFREQUENZ
VON
PLASMID-DNA
.
123
6.5
ITR-PLASMIDE
KOENNEN
IN
HUMANEN
ZELLEN
IN
ANWESENHEIT
DER
REP-PROTEINE
VON
AAV
ORTSSPEZIFISCH
INTEGRIEREN
.127
6.6 PLASMIDE
MIT
DEM
REP-GEN
VON
AAV,
JEDOCH
OHNE
ITRS
INTEGRIEREN
IN
HUMANEN
ZELLEN
ORTSSPEZIFISCH
.
131
7.
LITERATURVERZEICHNIS
.
134
8.
ABKUERZUNGEN
.143 |
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| author | Steigerwald, Robin |
| author_facet | Steigerwald, Robin |
| author_role | aut |
| author_sort | Steigerwald, Robin |
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