Analyse der chromosomalen Verteilung der HERV-T(S71)-Familie humaner endogener retroviraler Elemente und Charakterisierung eines strukturell vollständigen Provirus:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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| Veröffentlicht: |
1998
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INHALTSVERZEICHNIS
I
A.
EINLEITUNG
.
1
1.
ALLGEMEINE
MERKMALE
EXOGENER
UND
ENDOGENER
RETROVIREN
.
1
1.1.
KLASSIFIZIERUNG
DER
RETROVIREN
.
1
1.2.
GENOMORGANISATION
UND
PROTEINPRODUKTE
DER
RETROVIREN
.
4
1.3.
MORPHOLOGIE
DER
RETROVIREN
.
6
1.4.
DER
RETROVIRALE
REPLIKATIONSZYKLUS
.
8
2.
DISKRIMINIERUNG
EXOGENER
UND
ENDOGENER
RETROVIREN
.
11
2.1.
STELLUNG
DER
ENDOGENEN
RETROVIREN
INNERHALB
DER
MOBILEN
GENETISCHEN
ELEMENTE
.
12
2.2.
VORKOMMEN
UND
HERKUNFT
ENDOGENER
RETROVIREN
.
14
2.3.
SYSTEMATIK
DER
HUMANEN
ENDOGENEN
RETROVIREN
(HERVS)
.
15
3.
BIOLOGISCHE
RELEVANZ
VON
HERVS
.
21
3.1.
HERVS
ALS
EVOLUTIV
WIRKSAME
FAKTOREN
.
21
3.2.
EINFLUSS
VON
HERVS
AUF
ZELLULAERE
FUNKTIONEN
.
22
3.3.1.
BEISPIELE
FUER
TRANSKRIPTIONELLE
AKTIVTAET
.
22
3.3.2.
POTENTIELLE
ROLLE
VON
HERVS
BEI
AUTOIMMUN
UND
TUMORERKRANKUNGEN
.
23
4.
DIE
S71-FAMILIE
ENDOGENER
RETROVIREN
.
24
5.
PROBLEMSTELLUNG
UND
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
.
28
B.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
29
1.
MATERIAL
.
29
1.1.
GENBANK
.
29
1.2.
BAKTERIENSTAEMME
.
29
1.3.
PLASMIDE
.
29
1.4.
ENZYME
.
30
1.5.
KITS
.
30
1.6.
ANTIKOERPER
.
30
1.7.
STANDARDPUFFER
.
30
1.8.
BAKTERIENNAEHRMEDIEN
.
31
2.
METHODEN
.
31
2.1.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
31
2.1.1.
ARBEITEN
MIT
1-PHAGEN
.
31
2.1.1.1.
HERSTELLUNG
PHAGEN
KOMPETENTER
MGSOX-BAKTERIEN
.
31
2.1.1.2.
TITERBESTIMMUNG
VON
1-PHAGEN
.
31
2.1.1.3.
AUSPLATTIEREN
EINER
1-PHAGEN
GENBANK
.
32
2.1.1.4.
HERSTELLUNG
VON
X-PHAGENLYSATEN
.
32
2.1.14.1.
PLATTENLYSATE
.
32
2.1.1.4.2.
SUSPENSIONSLYSATE
.
32
2.2.1.5
X-PHAGEN-DNA-ISOLIERUNG
(PLATTEN
UND
SUSPENSIONSLYSATE)
.
33
2.1.2.
PLASMID-DNA-ISOLIERUNG
.
33
2.1.3.
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
(PCR)
.
33
2.1.3.1
PRIMERAUSWAHL
UND
SYNTHESE
.
33
2.1.3.2.
REAKTIONSBEDINGUNGEN
DER
STANDARD-PCR
.
34
2.1.3.3.
ZYKLUSBEDINGUNGEN
DER
STANDARD-PCR
.
34
2.1.3.4.
AMPLIFIKATION
ZU
SEQUENZIERENDER/KLONIERENDER
PRODUKTE
.
34
2.1.4.
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
.
35
2.1.5.
BESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREKONZENTRATIONEN
.
35
2.1.5.1.
MINIGELE
.
35
2.1.5.2.
PHOTOMETER
.
35
2.1.6.
REINIGUNG
VON
DNA
.
36
2.1.6.1.
REINIGUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
UEBER
BIOSPIN30-SAEULEN
.
36
2.1.6.2.
REINIGUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
DEM
QIAQUICK
GELEXTRAKTIONS
KIT
.
36
2.1.6.3.
REINIGUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
DURCH
ELEKTROELUTION
.
36
2.1.7.
SPALTUNG
VON
DNA-MOLEKUELEN
DURCH
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
37
2.1.8.
KLONIERUNGEN
.
37
N
INHALTSVERZEICHNIS
2.1.9.
SEQUENZIERUNG
VON
PLASMIDEN
UND
PCR-PRODUKTEN
.
37
2.1.10.
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
DURCH
ELEKTROPORATION
.
38
2.1.10.1.
HERSTELLUNG
ELEKTROKOMPETENTER
ZELLEN
.
38
2.1.10.2.
ELEKTROPORATION
.
38
2.1.11.
SOUTHERN
BLOT
.
39
2.1.11.1.
KAPILLARBLOT
.
39
2.1.11.2.
BENTON-DAVIS-BLOT
.
39
2.1.12.
CLONTECH
NORTHEMBLOTS:
HYBRIDISIERUNG
UND
DEHYBRIDISIERUNG
.
39
2.1.13.
MARKIERUNG
VON
DNA-HYBRIDISIERUNGSSONDEN
.
40
2.1.14.
HYBRIDISIERUNG
DER
SOUTHERNBLOTS
.
40
2.1.15.
AUTORADIOGRAPHIE
.
41
2.1.16.
DEHYBRIDISIERUNG
.
42
2.2.
ZELLKULTURTECHNIKEN
.
42
2.2.1.
ZELLIMEN
.
42
2.2.2.
PASSAGIEREN
DER
ZELLEN
.
42
2.2.3.
EINFRIEREN
DER
ZELLEN
.
42
2.2.4.
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
MITTELS
ELEKTROPORATION
.
43
2.2.5.
HERSTELLUNG
VON
ZELLEXTRAKTEN
.
44
2.3.
PROTEINTECHNIKEN
.
44
2.3.1.
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
PIERCE
.
44
2.3.2.
FAERBUNG
VON
SS-GALAKTOSIDASE
EXPRIMIERENDEN
ZELLEN
.
44
2.3.3.
SS-GALAKTOSIDASE-ASSAY
.
45
2.3.4.
LUZIFERASE-ASSAY
.
45
2.4.
ZYTOGENETISCHE
METHODEN
.
46
2.4.1
ETABLIERUNG
VON
BLUTKULTUREN
.
46
2.4.2.
PRAEPARATION
VON
METAPHASE-CHROMOSOMEN
KULTIVIERTER
LYMPHOZYTEN
AUS
PERIPHEREM
BLUT
.
46
2.4.3.
FLUORESZENZ
IN
SITU
HYBRIDISIERUNG
(FISH)
.
47
2.4.3.1.
MARKIERUNG
DER
DNA-SONDE
.
47
2.4.3.2.
HYBRIDISIERUNG
DER
DNA-SONDE
.
48
2.4.3.3.
DETEKTION
DER
HYBRIDISIERTEN
DNA-SONDE
.
48
2.4.3.4.
PHOTODOKUMENTATION
.
49
2.5.
COMPUTERPROGRAMME
ZUR
DNA
UND
PROTEINSEQUENZANALYSE
.
49
2.5.1.
SAMMLUNG
DER
DNA-SEQUENZINFORMATION
.
49
2.5.2
DATENBANKVERGLEICHE
.
49
2.5.3.
SEQUENZANALYSE-PROGRAMME
.
49
C.
ERGEBNISSE
.
51
1.
ISOLIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
EINES
VOLLSTAENDIGEN
PROVIRUS
DER
HERV-T(S71)
FAMILIE.
51
1.1.
IDENTIFIZIERUNG
EINES
VOLLSTAENDIGEN
S71-VERWANDTEN
PROVIRUS
IM
HUMANEN
GENOM
.
51
1.1.1.
ISOLIERUNGSSTRATEGIE
.
51
1.1.2
UEBERPRUEFUNG
DER
INSERTS
DER
ISOLIERTEN
KLONE
DURCH
PCR-ANALYSE
.
53
1.1.3.
IDENTIFIZIERUNG
DER
RETROVIRALEN
SEQUENZEN
IN
KLON
1
.
55
1.1.4.
RESTRIKTIONSKARTIERUNG
DES
KLONS
1
UND
SUBKLONIERUNG
DER
INSERTSEQUENZEN
IN
DEN
VEKTOR
PUC19
.
56
1.
2.
SEQUENZANALYSE
.
58
1.2.1.
SEQUENZIERUNGSSTRATEGIE
UND
SEQUENZIERTE
BEREICHE
VON
KLON
1
.
58
1.2.2.
PROVIRALE
STRUKTUR
VON
S71A
.
60
1.2.3.
IDENTIFIZIERUNG
UND
SEQUENZVERGLEICHE
DER
S71A
LTRS
.
68
1.2.3.1.
DIE
S71A
LTRS
SIND
HOMOLOGER
ZUEINANDER
UND
KUERZER
ALS
DIE
S71
LTRS
.
68
1.2.3.2.
DIE
S71
UND
S71ALTRS
ZEIGEN
EINE
HOHE
HOMOLOGIE
ZU
EINER
CPG-LNSEL
.
72
1.2.4.
EINE
UNGEWOEHNLICH
LANGE
JEADER
"
-
REGION
IST
CHARAKTERISTISCH
FUER
DIE
HERVT(S71)
FAMILIE
.
74
1.2.5.
SEQUENZANALYSE
DER
S71A
GAG
REGION
.
76
1.2.6.
SEQUENZANALYSE
DER
S71A
POL
-
REGION
.
80
1.2.6.1.
IDENTISCHE
PUNKTMUTATIONEN
IN
HERV(T)-S71-PO/-REGIONEN
WEISEN
AUF
EINEN
PASSIVEN
VERBREITUNGSMECHANISMUS
HIN
.
80
1.2.6.2
DIE
INTEGRASE-REGION
VON
S71A
IST
PHYLOGENETISCH
WIE
DIE
CAPSID-REGION
EINZUORDNEN
.
81
1.2.7.
SEQUENZANALYSE
DES
S71A
ENV-GENS
.
83
1.2.7.1
DAS
ENV-GEN
VON
S71A
ENTHAELT
KONSERVIERTE
SEQUENZBEREICHE
.
83
INHALTSVERZEICHNIS
M
1.2.7.2.
DIE
ENV-GENE
ALLER
HERV-T(S71)-MITGLIEDER
SIND
IM
5'
-BEREICH
NAHE
ZU
MULV
VERWANDT
.
85
1.2.8
EIN
TEIL
DER
3'-FLANKIERENDEN
SEQUENZ
DES
S71A-LOCUS
WEIST
HOMOLOGIE
ZU
ALU
SEQUENZEN
AUF
.
88
2.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
EXPRESSION
DER
HERV-T(S71)
FAMILIE
.
88
2.1.
TRANSKRIPTE
IN
NORMALEM
GEWEBE
UND
TUMORZELLEN
.
88
2.2.
AKTIVITAET
DES
S71A
LTR
.
91
2.2.1
SUBKLONIERUNG
DES
5
'
LTR
VON
S71A
IN
EINEN
LUZIFERASEVEKTOR
.
91
2.2.2.
DAS
S71A
5
'
LTR
IST
NICHT
AKTIV
IN
HEIA-,
LC5
UND
K562-ZELLEN
.
91
3.
CHROMOSOMALE
VERTEILUNG
DER
HERV-T(S71)
FAMILIE
.
92
3.1.
ERMITTLUNG
DER
OPTIMALEN
HYBRIDISIERUNGSBEDINGUNGEN
UND
ABSCHAETZUNG
DER
KOPIEN
VON
HERV-T(S71)
IM
MENSCHLICHEN
GENOM
.
94
3.
2.
CHROMOSOMALE
VERTEILUNG
VON
HERV-T(S71):
KONZENTRIERUNG
AUF
BESTIMMTEN
CHROMOSOMEN
.
99
3.2.2.
HERKUNFT
DER
VERWENDETEN
SONDEN
UND
DIE
DAMIT
ERHALTENEN
HYBRIDISIERUNGSSIGNALE
.
100
3.3.3.
PCR-ANALYSE
VON
S71-VERWANDTEN
RT-SEQUENZEN
IN
MONOCHROMOSOMALER
DNA
.
106
3.4.
ANALYSE
DER
CHROMOSOMALEN
VERTEILUNG
VON
HERV-T(S71)
SEQUENZEN
DURCH
FLUORESZENZ
IN
SITU
-HYBRIDISIERUNGEN
(FISH)
AN
METAPHASE-CHROMOSOMEN
.
108
3.4.1.
AUSWAHL
EINER
GEEIGNETEN
SONDE
FUER
FLUORESZENZ
IN
SITU
HYBRIDISIERUNG
.
108
3.4.2.
HERV-T(
S71)-PROVIREN
LIEGEN
BEVORZUGT
IN
TRANSKRIPTIONSAKTIVEN
BEREICHEN
UND
IN
ZENTROMER-NAEHE
.
108
3.4.3.
VERGLEICH
DER
MIT
VERSCHIEDENEN
METHODEN
GEWONNENEN
S71-LOKALISIERUNGSDATEN
.
111
D.
DISKUSSION
.
114
1.
SEQUENZANALYSE
VON
S71A
.
115
2.
EXPRESSION
VON
HERV-T(S71)
SPEZIFISCHER
MRNA
IN
VERSCHIEDENEN
GEWEBEN
.
122
3.
CHROMOSOMALE
VERTEILUNG
UND
LOKALISIERUNG
VON
HERV-T(S71)
.
124
E.
ZUSAMMENFASSUNG
.
128
F.
LITERATURVERZEICHNIS
.
130
ABKUERZUNGEN
.
142 |
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