Charakterisierung von spezifischen Mutanten des Reaktionszentrums von Rhodopseudomonas viridis:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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1995
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| adam_text | - 33O DISSERTATION DER FAKULTAET FUER CHEMIE UND PHARMAZIE DER
LUDWIG-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET MUENCHEN CHARAKTERISIERUNG VON
SPEZIFISCHEN MUTANTEN DES REAKTIONSZENTRUMS VON RHODOPSEUDOMONAS VIRIDIS
VON DIPL.-BIOCHEM. BARBARA DOHSE AUS TUEBINGEN MUENCHEN 1995
INHALTSVERZEICHNIS I.ZUSAMMENFASSUNG 7 2. EINLEITUNG 11 2.1. DAS PRINZIP
DER PHOTOSYNTHESE 11 2.2. DIE BAKTERIELLE PHOTOSYNTHESE: ZYKLISCHER
ELEKTRONENTRANSFER 14 2.3. DAS BAKTERIELLE REAKTIONSZENTRUM 17 2.4. DAS
PUF-OPERON: ORGANISATION, DELETION UND MUTANTEN 20 2.5. ZIELSETZUNG DER
ARBEIT 22 3. MATERIAL UND METHODEN 27 3.1. MATERIAL 27 3.1.1.
CHEMIKALIEN 27 3.1.2. ENZYME 28 3.1.3. MEDIEN UND PUTTER 28 3.1.4.
BAKTERIENSTAEMME 32 3.1.5. PLASMIDE 34 3.1.6. OLIGODESOXYNUCLEOTIDE 34
3.2. MIKROBIOLOGISCHE METHODEN 35 3.2.1. ANZUCHT VON RHODOPSEUDOMONAS
VIRIDIS: 35 3.2.1.1. PHOTOTROPHE ZELLZUCHT 35 3.2.1.2. MIKROAEROBES
WACHSTUM 35 3.2.1.3. AEROBES WACHSTUM 36 3.2.2. ANZUCHT VON ESCHERICHIA
COLI 36 3.2.3. STAMMHALTUNG VON BAKTENENZELLEN 37 3.2.4. WACHSTUMSKURVEN
37 3.2.5. ZELLZAHL-/LEBENDZELLZAHL-BESTIMMUNG 37 3.2.6. MESSUNG DES
SAUERSTOFFPARTIALDRUCKS IN KULTUREN 38 3.2.7. GENTRANSFERMETHODEN 38
3.2.7.1. HERSTELLUNG KOMPETENTER ZELLEN 38 3.2.7.2. TRANSFORMALION VON
E. COLI 39 3.2.7.3. KONJUGATION VON RPS. VIRIDIS 40 3.2.7.4.
TRANSFORMATION VON RPS. VIRIDIS 40 3.3. PROTEINCHEMISCHE METHODEN 41
3.3.1. ZELLAUFSCHLUSS UND ISOLIERUNG VON CHROMATOPHOREN 41 3.3.2.
SOLUBILISIERUNG DES REAKTIONSZENTRUMS 41 3.3.3.
ZUCKERGRADIENTENZENTRIFUGATION 41 3.3.4. LONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
42 3.3.5. REINIGUNG VON RC DURCH MOLEKULARSIEBFILTRATION 42 3.3.6.
SDS-PAGE 44 3.3.7. KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON PROTEINEN 45 3.3.8.
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG DES REAKTIONSZENTRUMS 45 3.3.9.
PIGMENTEXTRAKTION UND IDENTIFIZIERUNG MIT HILFE VON HPLC 45 3.4.
IMMUNOLOGISCHE METHODEN 46 3.4.1. IMMUNISIERUNG VON KANINCHEN UND
GEWINNUNG VON ANTI-RC SERUM 46 3.4.2. WESTERN BLOT UND IMMUNOLOGISCHE
DETEKTION 46 3.5. MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 48 3.5.7. ISOLIERUNG VON
DNA 48 3.5.1.1. MINIPRAEPARATION VON PLASMID-DNA AUS . COLI-KULTUREN 48
3.5.1.2. MINIPRAEPARATION VON PLASMID-DNA AUS . COLI VON PLATTEN 48
3.5.1.3. PRAEPARATIVE ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS E. COLI 49 3.5.1.4.
PRAEPARATION VON GESAMT-DNA AUS RPS. VIRIDIS 49 3.5.1.5.
DNA-AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 50 3.5.1.6. ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN
AUS AGAROSE-GCLEN 50 3.5.2. ARBEITEN AN DNA IN VITRO 50 3.5.2.1. DAS
SCHNEIDEN VON DNA MIT RESLRIKLIONSENZYTNEN 50 3.5.2.2.
DEPHOSPHOIYLIENING VON DNA-FRAGMENTEN 51 3.5.2.3. LIGATION 51
3.5.2.4.-POLYMERASE-KETTEN-REAKTION(PCR) 51 3.5.2.5. SOUTHERN BLOT 54
3.5.2.6. HYBRIDISIERUNG MIT DIGOXYGENIN-MARKIERTEN SONDEN 54 3.6.
SPEKTROSKOPISCHE METHODEN 55 3.6.7. ABSORPTIONSSPEKTREN 55 3.6.2.
LICHTINDUZIERTE LADUNGSTRENNUNG IN GANZEN ZELLEN UND ISOLIERTEN
REAKTIONSZENTREN 55 3.6.3. CHEMISCHE OXIDATION VON PIN ISOLIERTEN
REAKTIONSZENTREN 56 3.6.4. ELEKTROCHEMISCHE REDOXTITRATION 56 3.6.5.
SPEKTREN IN ZIRKULAR POLARISIERTEM LICHT (CD-SPEKTREN) 57 3.7.
KINETISCHE ANALYSEN 59 3.7.1. REDUKTION DES OXIDIERTEN BCHLB-DIMERS
DURCH FESTGEBUNDENES CYTOCHROMC 59 3. 7.2. ULTRASCHNELLER
ELEKTRONENTRANSFER UEBER DIE EINZELNEN PIGMENTE IM RC 59 3.7.3. MESSUNG
DER REKOMBINATIONSRATE VON REDUZIERTEM MENACHINON ZU OXIDIERTEM
BCHLB-DIMER. 60 4. ERGEBNISSE 63 4.1. WACHSTUMSBEDINGUNGEN FUER RPS.
VIRIDIS 63 4.1.1. MIKROAEROBES WACHSTUM 63 4.1.2. RC-LNDUKTION UNTER
MIKROAEROBEN BEDINGUNGEN 66 4.1.2.1. RC-LSOLIERUNG AUS MIKROAEROB
GEWACHSENEN KULTUREN 66 4.1.2.2. WESTERN BLOT-ANALYSEN VON PHOF-MUTANTEN
68 4.1.3. WECHSEL VON MIKROAEROBEM ZU PHOTOTROPHEM WACHSTUM 71 4.1.4.
AEROBES WACHSTUM 72 4.2. BIOPHYSIKALISCHE CHARAKTERISIERUNG VON MUTANTEN
DES RC 73 4.2.1. L 162 TYROSIN: MUTANTEN DER ELEKTRONENDONORSEITE 73
4.2.1.1. PHOTOSYNTHETISCHES WACHSTUM 74 4.2.1.2. CHARAKTERISIERUNG DER
ISOLIERTEN RCS 75 4.2.1.3. PHOTOINDUZIERTE DIFFERENZSPEKLREN VON GANZEN
ZELLEN UND ISOLIERTEN RCS 77 4.2.1.4. ELEKTROCHEMISCHE REDOXTITRATION 80
4.2.1.5. REDUKTION DES PHOTOOXIDIERTEN SPECIAL PAIR DURCH DAS CYTOCHROM
C 84 4.2.2. L 153 HISTIDIN: DIE PIGMENTZUSAMMENSETZUNG UND DER
ELEKTRONENTRANSFER IM RC 89 4.2.2.1. PHOLOSYNTHELISCHES WACHSTUM 91
4.2.2.2. CHARAKTERISIERUNG DER ISOLIERTEN RCS 92 4.2.2.3. CD-SPEKTREN 94
4.2.2.4. PIGMENTEXTRAKTION 95 4.2.2.5. LICHT- ODER CHEMISCH INDUZIERTE
DIFFERENZSPEKTREN UND ZEITLICHER VERLAUF DES BLEICHENS 99 4.2.2.6.
ELEKTROCHEMISCHE REDOXTITRATION 103 4.2.2.7. ELEKTRONENTRANSFER UEBER DIE
EINZELNEN PIGMENTE 104 4.2.2.8. MESSUNGEN DER REKOMBINATIONSRATEN AUS
EINZELNEN ZWISCHENZUSTAENDEN DES ELEKTRONENTRANSFERS 106 4.3.
KONSTRUKTION EINES CYTOCHROM C-DELETIONSSTAMMES 109 4.3.7. PRINZIP 111
4.3.2. VORGEHENSWEISE: KONSTRUKTION DES PLASMIDS PRKMIAC 7 11 4.3.3.
TRANSFORMATION DES DELETIONSSTAMMES RPS. VIRIDIS PUFALM 7/7 4.3.4.
CHARAKTERISIERUNG DES STAMMES RPS. VIRIDIS PUFLMAC 118 5. DISKUSSION 121
5.1. WACHSTUMSMOEGLICHKEITEN FUER RHODOPSEUDOMONAS VIRIDIS 121 5.7.7.
MIKROAEROBES WACHSTUM . . 72J 5.1.2. AEROBES WACHSTUM 123 5.2.
CHARAKTERISIERUNG VON MUTANTENDES REAKTIONSZENTRUMS 124 5.2.1. REDUKTION
DES PHOTOOXIDIERTEN RC: DIE L 162 MUTANTEN 724 5.2.2. AENDERUNG DER
PIGMENTZUSAMMENSETZUNG: DIE L 153 MUTANTEN 127 5.3. DELETION DES CYT
C-GENS IM PUF-OPERON 131 6. UTERATUR 135 7. ABKUERZUNGEN 147
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