Klonierung und heterologe Expression der Codeinon-Reduktase aus Papaver somniferum L.:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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1999
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| adam_text | DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES DOKTORGRADES DER FAKULTAET FUER CHEMIE UND
PHARMAZIE DER LUDWIG-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET MUENCHEN KLONIERUNG UND
HETEROLOGE EXPRESSION DER CODEINON-REDUKTASE AUS PAPAVER SOMNIFERUM L.
VON BERNHARD UNTERLINNER AUS PRIEN 1999 INHALTSVERZEICHNIS I EINLEITUNG
1 II MATERIAL UND METHODEN 19 1. BIOLOGISCHES MATERIAL 19 1.1
PFLANZLICHES MATERIAL 19 1.2 BAKTERIEN 20 1.3 INSEKTENZELLEN : 21 2.
NUKLEINSAEUREN UND NUKLEOTIDE 22 3. ENZYME UND ENZYMKITS 23 4.
CHEMIKALIEN 24 5. GERAETE 26 6. SONSTIGES 28 7. SYNTHESEN 29 7.1 SYNTHESE
VON SALUTARIDINOL AUS SALUTARIDIN 29 7.2 SYNTHESE VON MORPHINON AUS
MORPHIN 30 8. ISOLIERUNG VON NUKLEINSAEUREN 30 8.1 ISOLIERUNG VON
GESAMT-RNS 30 8.2 ISOLIERUNG VON POLY(A) + -RNS 33 8.3 ISOLIERUNG
GENOMISCHER DNS 33 8.4 ISOLIERUNG BAKTERIELLER PLASMID-DNS (MINIPREP) 36
8.5 ISOLIERUNG BAKTERIELLER PLASMID-DNS IM GROSSMASSSTAB ... 37 8.6
ISOLIERUNG VON DNS AUS IN VITRO SYSTEMEN 38 9. ENZYMATISCHE MODIFIKATION
VON NUKLEINSAEUREN 3 8 9.1 VERDAU MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 38 9.2
LIGATION 39 9.3 REVERSE TRANSKRIPTION 39 9.4 RADIOAKTIVE MARKIERUNG MIT
DEM RADPRIME DNA LABELING SYSTEM 40 9.5 RADIOAKTIVE ENDMARKIERUNG VON
OLIGONUKLEOTIDEN 41 10. SUBKLONIERUNG UND SEQUENZIERUNG VON DNS 41 10.1
SUBKLONIERUNG VON DNS 41 10.2 SEQUENZIERUNG VON DNS 42 11.
ELEKTROPHORESE VON NUKLEINSAEUREN 42 11.1 AGAROSEGELE 42 11.2
POLYACRYLAMIDGELE 44 12. NUKLEINSAEURE-BLOTS ! 44 12.1 NORTHERN-BLOT 44
12.2 SOUTHERN-BLOT 45 12.3 HYBRIDISIERUNG MIT OLIGONUKLEOTIDEN 46 12.4
HYBRIDISIERUNG MIT CDNS-SONDEN 47 12.5 ENTFERNEN VON
HYBRIDISIERUNGSSONDEN 48 13. POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR) 48 13.1
REAKTIONSBEDINGUNGEN 48 13.2 OLIGONUKLEOTIDE (PCR-PRIMER) 51 14.
KONSTRUKTION EINER CDNS-BIBLIOTHEK UND ISOLIERUNG EINES VOLLAENGEKLONS
DER CODEINON-REDUKTASE -. 14.1 PRINZIP DES MARATHON CDNA AMPLIFICATION
KIT 54 14.2 SPEZIELLE MODIFIKATIONEN DER MARATHON METHODE 57 15.
ISOLIERUNG VON ISOFORMEN ZUR CODEINON-REDUKTASE 57 16. PROTEINEXPRESSION
IN BAKTERIEN 60 16.1 KONSTRUKTION DES EXPRESSIONSVEKTORS 60 16.2
HERSTELLUNG KOMPETENTER ZELLEN 61 16.3 TRANSFORMATION KOMPETENTER ZELLEN
61 16.4 KULTIVIERUNG UND AUFSCHLUSS TRANSFORMIERTER ZELLEN 62 17.
PROTEINEXPRESSION IN INSEKTENZELLEN 62 17.1 HERSTELLUNG REKOMBINANTER
BACMID-DNS 62 17.2 TRANSFEKTION VON SF9-INSEKTENZELLEN MIT REKOMBINANTER
BACMID-DNS ZUR GEWINNUNG DES PHAGENSTOCKS 63 17.3 INFEKTION VON
SF9-INSEKTENZELLEN MIT PHAGENSTOCK ZUR HETEROLOGEN PROTEINEXPRESSION 64
18. ENZYMTESTS DER CODEINON-REDUKTASE 64 18.1 GEWINNUNG DES PFLANZLICHEN
ROHEXTRAKTES 64 18.2 TESTMOEGLICHKEITEN DER CODEINON-REDUKTASE 65 19.
REINIGUNG DER IN BAKTERIEN HETEROLOG EXPRIMIERTEN CODEINON-REDUKTASEN :
67 20. IMMUNOLOGISCHE VERFAHREN: WESTERN-BLOT-ANALYSE DER HETEROLOG
EXPRIMIERTEN CODEINON-REDUKTASE 69 21. ELEKTROPHORESE VON PROTEINEN 70
21.1 SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE 70 21.2 FAERBEN VON PROTEINGELEN
72 22. CHROMATOGRAPHISCHE METHODEN 73 22.1 DUENNSCHICHT-CHROMATOGRAPHIE
73 22.2 HPLC 74 23. SPEKTROSKOPISCHE METHODEN 76 23.1
KERNRESONANZ-SPEKTROSKOPIE 76 23.2 MASSEN-SPEKTROSKOPIE 76 24.
PROTEINBESTIMMUNG 76 25. RADIOAKTIVITAETSBESTIMMUNG 77 26.
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN 77 27. RECHNERGESTUETZTE
GENANALYSEN UND DATENBANKVERGLEICHE .. 78 III ERGEBNISSE 79 1. CDNS DER
CODEINON-REDUKTASEN 79 1.1 TEILSEQUENZEN . 79 1.2 VOLLAENGESEQUENZEN 81
2. HETEROLOGE EXPRESSION DER CODEINON-REDUKTASEN 87 2.1 EXPRESSION IN E.
COLI 87 2.2 EXPRESSION IN INSEKTENZELLEN 88 2.3 VERGLEICHENDE
DARSTELLUNG DER EXPRESSIONEN 88 III 3. ENZYMATISCHE CHARAKTERISIERUNG 90
3.1 REINIGUNG 90 3.2 IDENTIFIZIERUNG DER REAKTIONSPRODUKTE 91 3.3
PH-OPTIMA 96 3.4 TEMPERATUROPTIMA 96 3.5 SUBSTRATSPEZIFITAET 99 3.6 K M
-WERTE 102 3.7 COFAKTORABHAENGIGKEIT UND STEREOSPEZIFITAET DER HYDRID- 106
IONENUEBERTRAGUNG 3.8 VERGLEICH DER CODEINON-REDUKTASE ISOFORMEN 109 4.
VERTEILUNG DER CODEINON-REDUKTASEN IN PAPAVER SOMNI- 110 FERUM L 4.1
NORTHERN-BLOT- ANALYSE 110 4.2 VERTEILUNG DER ENZYMAKTIVITAET 111 5.
BETRACHTUNGEN AUF GENOMISCHER EBENE 114 5.1 SOUTHERN-BLOT-ANALYSE 114
5.2 INTRON 116 6. RECHNERGESTUETZTE GENANALYSEN 117 6.1 ANALYSE DER
PRIMAERSTRUKTUR 117 6.2 BETRACHTUNGEN ZU HOEHEREN STRUKTUREBENEN 119 7.
CDNS EINES ZUR CODEINON-REDUKTASE HOMOLOGEN GENS 123 7.1 ISOLIERUNG DER
CDNS 123 7.2 ALLGEMEINE BETRACHTUNGEN 126 8. IMMUNOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGEN 126 9. CODON USAGE 129 10. BETRACHTUNGEN ZUR
SALUTARIDINOL-7-O-ACETYLTRANSFERASE .... 135 IV DISKUSSION 138 V
ZUSAMMENFASSUNG 146 VI LITERATUR 149 IV
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