Mikroanalyse einzelner Zellen und Kompartimente transgener Pflanzen mittels biophysikalischer Methoden:
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| Sprache: | German |
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1998
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| Beschreibung: | Potsdam, Univ., Diss., 1998 |
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 PHOTOASSIMILATION DURCH DEN REDUKTIVEN PENTOSEPHOSPHATZYKLUS 1
1.2 DIURNALE REGULATION VON KOHLENSTOFFVERTEILUNG UND EXPORT 2
1.3 INTER- UND INTRAZELLULAERE KOMPARTIMENTIERUNG 3
1.4 EINFLUSS DER PHOTOASSIMILATION AUF TURGORDRUCK UND
MEMBRANPOTENTIAL 4
1.5 SACCHAROSETRANSPORT 6
1.5.1 PHLOEMBELADUNG 6
1.5.2 MECHANISMUS DES PHLOEMTRANSPORTS 7
1.6 PHLOEMINHALTSSTOFFE 8
1.6.1 IONEN 9
1.6.2 PROTEINE 9
1.7 ZIELSETZUNG 12
2 MATERIAL UND METHODEN 13
2.1 CHEMIKALIEN UND ENZYME 13
2.2 GERAETE 13
2.3 PFLANZEN 14
2.3.1 KARTOFFELPFLANZEN 14
2.3.1.1 PLASTIDAERE FRUKTOSE-L,6-BISPHOSPHATASE (FBPASE) ANTISENSE
PFLANZEN 14
2.3.1.2 TRIOSEPHOSPHAT-TRANSLOKATOR (TPT) ANTISENSE PFLANZEN 14
2.3.1.3 ADP-GLUKOSE-PYROPHOSPHORYLASE (AGPASE) ANTISENSE PFLANZEN 15
2.3.1.4 SACCHAROSE TRANSPORTER (SUT) ANTISENSE PFLANZEN 15
2.3.2 GURKEN- UND KUERBISPFLANZEN 15
2.4 PROBENGEWINNUNG UND -AUFBEWAHRUNG 16
2.4.1 GEWINNUNG VON PROBEN AUS EPIDERMIS- UND MESOPHYLLZELLEN 16
2.4.2 SPANNUNGSGESTEUERTE PROBENENTNAHME 17
2.4.3 GEWINNUNG VON PROBEN AUS FLUORESZEIN-MARKIERTEN ZELLEN 18
2.4.4 PROBENENTNAHME AUS GFP-MARKIERTEN ZELLEN 19
2.4.5 PROBENENTNAHME FUER DIE RT-PCR 19
2.4.6 GEWINNUNG VON PHLOEMPROBEN MITTELS APHIDENTECHNIK 19
2.4.7 GEWINNUNG VON PHLOEMPROBEN AUS GURKE UND KUERBIS 20
2.4.8 HERSTELLUNG VON MIKROKAPILLAREN 20
2.4.8.1 SILANIEREN DER KAPILLAREN 20
I
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
2.4.9 AUFBEWAHRUNG DER PROBEN 21
2.5 MIKROFLUOROMETRISCHE BESTIMMUNG VON GLUKOSE, FRUKTOSE UND
SACCHAROSE 21
2.5.1 HERSTELLUNG DER KONSTRIKTIONSPIPETTEN 22
2.6 MESSUNG DER OSMOLALITAET 23
2.7 IONENBESTIMMUNG 23
2.7.1 BESTIMMUNG VON KALIUM IN EPIDERMISZELLEN 23
2.7.2 IONENBESTIMMUNG IM PHLOEMSAFT 24
2.8 TURGORMESSUNGEN 24
2.9 MEMBRANPOTENTIALMESSUNGEN 25
2.9.1 MESSUNGEN MIT STATIONAERER ELEKTRODE 25
2.9.2 MEMBRANPOTENTIAL-SUCHLAUFE 25
2.10 GASWECHSELMESSUNGEN 28
2.11 WACHSTUMSMESSUNGEN 28
2.12 RT-PCR AUS EINZELNEN ZELLEN 28
2.12.1
REVERSE TRANSKRIPTION (RT) 28
2.12.2 POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR) 28
2.12.3 DETEKTION DER PCR PRODUKTE 29
2.13 UNTERSUCHUNG UND IDENTIFIKATION VON PHLOEMPROTEINEN 30
2.13.1 VERSUCHSKONZEPT 30
2.13.2 SDS-PAGE 30
2.13.3 ELEKTROELUTION 31
2.13.4 IN SITU
GELVERDAU 31
2.13.5
AMINOSAEURESEQUENZANALYSE VON PHLOEMPROTEINEN 32
2.13.6 MASSENSPEKTROMETRIE 32
2.13.6.1 DIREKTE MALDI-TOF ANALYSE VON PHLOEMSAFT 32
2.13.6.2 MALDI-TOF ANALYSE VON ELEKTROELUIERTEN PROTEINEN 32
2.13.6.3 MALD1 SPEKTREN VON IM GEL VERDAUTEN PROTEINBANDEN 33
2.13.6.4 DATENBANKVERGLEICH 33
3 ERGEBNISSE 34
3.1 PROBENGEWINNUNG UND -AUFBEWAHRUNG 34
3.1.1 EINZELZELLPROBEN 34
3.1.2 SPANNUNGSGESTEUERTE PROBENENTNAHME 35
3.1.3 PROBENENTNAHME AUS SPEZIFISCH MARKIERTEN ZELLEN 36
3.1.4 PHLOEMPROBEN 36
3.1.5 PROBENAUFBEWAHRUNG 36
II
INHALTSVERZEICHNIS
3.2 AUSWIRKUNGEN DER ANTISENSE INHIBIERUNGEN AUF ZUCKER,
OSMOLALITAET, KALIUMKONZENTRATION, MEMBRANPOTENTIAL UND
ZELLGROESSEN IN EPIDERMISZELLEN 37
3.2.1 ZUCKERKONZENTRATIONEN 38
3.2.2 OSMOLALITAET 38
3.2.3 KALIUMKONZENTRATIONEN 40
3.2.4 TURGORDRUCK 40
3.2.5 WASSERZUSTAND DER ZELLEN 41
3.2.6 MEMBRANPOTENTIALMESSUNGEN 42
3.2.6.1 MESSUNGEN MIT STATIONAERER ELEKTRODE 42
3.2.6.2 MEMBRANSPANNUNGS-SUCHLAEUFE 43
3.2.6.3 ZELLDURCHMESSER 43
3.2.7 ZUSAMMENFASSUNG 44
3.3 MESSUNGEN DIURNALER AENDERUNGEN DER ZUCKERKONZENTRATION IN
EPIDERMIS- UND MESOPHYLLZELLEN UND AUSWIRKUNGEN AUF EXPORT UND
WACHSTUM 45
3.3.1 GASWECHSEL 45
3.3.2 DIURNALE AENDERUNGEN DER ZUCKERKONZENTRATIONEN 46
3.3.2.1 AENDERUNGEN IN SOURCE BLAETTERN 46
3.3.2.2 AENDERUNGEN IN EPIDERMISZELLEN VON INTERNODIEN (SINK) 47
3.3.2.3 AUSWIRKUNGEN AUF DEN ZUCKEREXPORT 48
3.3.3 DIURNALE AENDERUNGEN DES TURGORDRUCKES 48
3.3.3.1 AENDERUNGEN IN EPIDERMISZELLEN VON SOURCE BLATTERN 48
3.3.3.2 AENDERUNGEN IN EPIDERMISZELLEN VON INTERNODIEN 49
3.3.4 WACHSTUMSRATEN VON INTERNODIEN WAEHREND DER LICHT- BZW.
DUNKELPERIODE 50
3.3.5 ZUSAMMENFASSUNG 50
3.4 RT-PCR AUS EINZELNEN ZELLEN 51
3.5 UNTERSUCHUNGEN DER PHLOEMEXSUDATE VERSCHIEDENER ORGANE AN
CUCURBITACEEN
52
3.5.1 IONENVERTEILUNG 52
3.5.2 PROTEINMUSTER 53
3.5.2.1 DIREKTE PROTEINANALYSE MITTELS MALDI-TOF 53
3.5.2.2 GELELEKTROPHORESE 57
3.5.2.3 ANSEQUENZIERUNG VON PHLOEMPROTEINEN 58
3.5.2.4 MALDI SPEKTREN ELEKTROELUIERTER PROTEINE 60
3.5.2.5 PEPTIDMUSTER NACH TRYPSINVERDAU 61
3.5.3 UEBERTRAGUNG DER METHODEN DER PHLOEMSAFTANALYSE AUF APHIDENPROBEN
AUS KARTOFFELPFLANZEN 63
3.5.3.1 IONENBESTIMMUNG MITTELS KAPILLARELEKTROPHORESE 63
III
INHALTSVERZEICHNIS
3.53.2 PROTEINUNTERSUCHUNGEN MITTELS SDS-PAGE UND MALDI-TOF 64
3.5.4 ZUSAMMENFASSUNG 65
4 DISKUSSION 66
4.1 AUSWIRKUNGEN DER ANTISENSE INHIBIERUNGEN AUF ZUCKER,
OSMOLALITAET, KALIUM KONZENTRATION, MEMBRANPOTENTIAL UND
ZELLGROESSEN IN EPIDERMISZELLEN 66
4.1.1 DIE ZUCKERKONZENTRATIONEN SIND IN DEN EPIDERMISZELLEN DER
TRANSGENEN PFLANZEN DEUTLICH VERAENDERT 66
4.1.2 DIE OSMOLALITAET STEIGT ENTSPRECHEND DER ZUCKERKONZENTRATION 67
4.1.3 KALIUM WIRD NICHT GEGEN ZUCKER AUSGETAUSCHT 68
4.1.4 EINE HOHE OSMOLALITAET BEWIRKT EINEN HOHEN TURGORDRUCK 69
4.1.5 DIE VERAENDERUNGEN VON OSMOLALITAET UND TURGOR HABEN KEINE
AUSWIRKUNGEN AUF DAS MEMBRANPOTENTIAL 69
4.1.6 VERSCHIEDENE ZELLSCHICHTEN HABEN DAS GLEICHE MEMBRANPOTENTIAL 70
4.1.7 ZELLDURCHMESSER KOENNEN VOM TURGOR BEEINFLUSST WERDEN 71
4.2 MESSUNGEN DIURNALER AENDERUNGEN DER ZUCKERKONZENTRATION IN
EPIDERMIS- UND MESOPHYLLZELLEN UND AUSWIRKUNGEN AUF EXPORT UND
WACHSTUM 72
4.2.1 DIE TRANSGENEN LINIEN ZEIGEN KEINE AENDERUNG DER PHOTOSYNTHESE 72
4.2.2 DIE ZUCKERKONZENTRATIONEN IN ZELLEN VON SOURCE BLAETTERN SIND
DEUTLICH VERAENDERT 72
4.2.3 DER EXPORT WAEHREND LICHT- UND DUNKELPERIODE IST DEUTLICH VERAENDERT
74
4.2.4 DER TURGORDRUCK VERHAELT SICH ENTSPRECHEND DEN
ZUCKERKONZENTRATIONEN 76
4.2.5 ZUCKER UND TURGOR IN EPIDERMISZELLEN VON INTERNODIEN SIND KAUM
VERAENDERT 76
4.2.6 DIE DIURNALEN WACHSTUMSMUSTER VON INTERNODIEN UNTERSCHEIDEN SICH
77
4.2.7 VERGLEICH DER EINZELZELLANALYSEN MIT LITERATURDATEN 78
4.3 PROBLEME UND MOEGLICHKEITEN DER EINZELZELLANALYTIK 79
4.4 PHLOEMUNTERSUCHUNGEN 81
4.4.1 ANALYSE DER PROTEINZUSAMMENSETZUNG MITTELS MALDI-MS UND SDS-PAGE
81
4.4.2 ORGANSPEZIFISCHE VERTEILUNG VON PHLOEMINHALTSSTOFFEN 83
5 ZUSAMMENFASSUNG 85
6 LITERATURVERZEICHNIS 87
IV |
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