Die Genfamilie der kleinen Internaline in Listeria monocytogenes und Listeria ivanovii:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1999
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1 ZUSAMMENFASSUNG.
1
2 EINLEITUNG. 4
ZIELSETZUNG DER ARBEIT. 12
3 ERGEBNISSE. 13
3.1 ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON
INLC: EIN NEUES MITGLIED
DER INTEMALIN-MULTIGENFAMILIE IN L. MONOCYTOGENES. . 13
3.1.1 DETEKTION EINES NEUEN PRFA-ABHAENGIGEN 30 KDA-PROTEINS IM
KULTURUEBERSTAND VON L. MONOCYTOGENES EGD. 13
3.1.2 PARTIELLE AUFREINIGUNG DES PRFA-ABHAENGIGEN 30 KDA-PROTEINS:
ZWEIDIMENSIONALE GELELEKTROPHORESE UND FPLC. 16
3.1.3 SEQUENZANALYSE DES PARTIELL GEREINIGTEN 30 KDA-PROTEINS. 18
3.1.4 VOM PROTEIN ZUM GEN: IDENTIFIKATION UND ISOLIERUNG DES
I'N/C-GENS MIT HILFE DER POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR). 19
3.2 EXPRESSION VON
INLC. 25
3.2.1 REGULATION DER /N/C-TRANSKRIPTION DURCH PRFA
3.2.1.1 BESTIMMUNG DES TRANSKRIPTIONS-STARTPUNKTES VON
INLC
DURCH "PRIMER EXTENSION" (PE). 25
3.2.1.2 NORTHERN BLOT-ANALYSE. 26
3.2.2 EXPRESSION VON
INLC IN DER WIRTSZELLE. 27
3.3 KONSTRUKTION UND CHARAKTERISIERUNG EINER M/C-DELETIONSMUTANTE . 28
3.3.1 KONSTRUKTION DER MUTANTE
L. MONOCYTOGENES AINLC. 28
3.3.2 INVASION UND INTRAZELLULAERE VERMEHRUNG VON
L. MONOCYTOGENES AINLC IN ZELLKULTUR. 30
3.3.3 MAUS-VIRULENZTESTS MIT
L. MONOCYTOGENES AINLC. 31
3.3.3.1 BESTIMMUNG DER LD
50. 31
3.3.3.2 LEBENDZELLZAHL IN MILZ UND LEBER. 32
3.3.3.3 HISTOPATHOLOGIE VON MILZ UND LEBER. 34
3.4 DIE IN/C-REGION VON
L. MONOCYTOGENES EGD. 38
3.5 NEUE INTEMALIN-GENE IN
L. IVANOVII (1): I-INLC UND I-INLD. 39
3.5.1 NACHWEIS DES (I-)M/C-GENS IN
L. IVANOVII ATCC 19119:
SOUTHERN BLOT- UND PCR-ANALYSEN. 39
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/957593783
INHALTSVERZEICHNIS
3.5.2 KLONIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER I-IW/DC-REGION
VON L. IVANOVII ATCC 19119. 41
3.5.3 PRFA-ABHAENGIGE TRANSKRIPTION VON I-INLC UND I-INLD. 45
3.5.3.1 BESTIMMUNG DER TRANSKRIPTIONS-STARTPUNKTE VON I-IN/C UND I
-INLD
DURCH "PRIMER EXTENSION" (PE). 45
3.5.3.2 NORTHERN BLOT-ANALYSEN.
47
3.5.4 SOUTHERN BLOT-ANALYSEN VON
L. MONOCYTOGENES- UND
L. IVANOVII-DNA MIT I-INLC- UND I-M/D-GENSONDEN:
WEITERE //-HOMOLOGE SEQUENZEN IN L IVANOVII.(. 47
3.6 NEUE INTEMALIN-GENE INZ.
IVANOVII (2): I-INLE UND I-INLF. 49
3.6.1 KLONIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER I-IN/FE-REGION
VON L. IVANOVII ATCC 19119. 49
3.6.2 EXPRESSION VON
I-INLE UND I-INLF: ABHAENGIGKEIT VON PRFA. 53
3.6.2.1 BESTIMMUNG DER TRANSKRIPTIONS-STARTPUNKTE VON I-INLE UND I-INLF
DURCH "PRIMER EXTENSION" (PE). 53
3.6.2.2 NORTHERN BLOT-ANALYSEN.
55
3.6.2.3 PRFA-ABHAENGIGE EXPRESSION DES I-INLE-PROTEINS. 56
3.6.3 SOUTHERN BLOT-ANALYSEN VON L. MONOCYTOGENES- UND
L. IVFLMOVI'I'-DNA MIT I-W/E-GENSONDEN. 58
3.6.4 KONSTRUKTION UND CHARAKTERISIERUNG VON
I-INLE-, I-INLF-, UND I-INLFE-
DELETIONSMUTANTEN - ATTENUATION IM MAUSMODELL. 59
4 DISKUSSION. 63
5 MATERIAL. 76
5.1 GERAETE.
76
5.2 CHEMIKALIEN, ENZYME UND FERTIGSAETZE ("KITS").
77
5.3 BAKTERIENSTAEMME.
77
5.4 VEKTOREN UND PLASMIDE.
78
5.5 ZELLINIEN. 81
5.6 MATERIAL UND MEDIEN FUER DIE ZELLKULTUR. 81
5.7 NAEHRMEDIEN, AGARPLATTEN UND MEDIENZUSAETZE. 82
5.8 PUFFER UND LOESUNGEN. 84
5.9 OLIGONUKLEOTIDE. 85
5.10 MOLEKULARGEWICHTSSTANDARDS. 88
6 METHODEN. 89
6.1 ARBEITEN MIT DNA. 89
6.1.1 HORIZONTALE AGAROSE-GELELEKTROPHORESE UND
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DNA UND OLIGONUKLEOTIDEN. 89
INHALTSVERZEICHNIS
6.1.2 TRANSFORMATION MIT PLASMID-DNA. 89
6.1.2.1 KOMPETENTE ZELLEN UND TRANSFORMATION VON
E. COLI. 89
6.1.2.2 TRANSFORMATION VON
LISTERIA SPP. 90
6.1.2.2.1 TRANSFORMATION VON PROTOPLASTEN. 90
6.1.2.2.2 ELEKTROPORATION. 91
6.1.3 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA. 91
6.1.3.1 PLASMID-DNA AUS
E. COLI. 91
6.1.3.2 PLASMID-DNA AUS
LISTERIA SPP. 92
6.1.4 ISOLIERUNG CHROMOSOMALER DNA AUS
LISTERIA SPP. . 92
6.1.5 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR). 93
6.1.5.1 STANDARD-PCR. 93
6.1.5.2 PCR MIT DEGENERIERTEN OLIGONUKLEOTIDEN. 94
6.1.5.3 INVERSE PCR. 94
6.1.6 REINIGUNG UND KONZENTRIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN. 96
6.1.7 KLENOW-/T4-POLYNUKLEOTIDKINASE(PNK)-BEHANDLUNG. 96
6.1.8 ALKALISCHE PHOSPHATASE (AP)-BEHANDLUNG.~. 96
6.1.9 SPALTUNG VON DNA MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN. 97
6.1.10 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN. 97
6.1.11 DNA-SEQUENZIERUNG. 97
6.1.11.1 KLONIERUNG UND SEQUENZIERUNG DER Z/Z/C-REGION VON
L. MONOCYTOGENES. 97
6.1.11.2 KLONIERUNG UND SEQUENZIERUNG DER I-Z'N/DC-REGION VON
L. IVANOVII. 98
6.1.11.3 KLONIERUNG UND SEQUENZIERUNG DER I-Z'ZZ/FE-REGION VON L,
IVANOVII. 98
6.1.12 SOUTHERN BLOT. 99
6.1.12.1 RADIOAKTIVE METHODE. 99
6.1.12.2 CHEMILUMINESZENZ (ECL)-METHODE. 101
6.1.13 KONSTRUKTION ISOGENER DELETIONSMUTANTEN. 101
6.1.13.1
L. MONOCYTOGENES AZN/C. 101
6.1.13.2
L. IVANOVII AI-ZZZ/E. 102
6.1.13.3 L. IVANOVII AI-Z'/Z/F. 102
6.1.13.4
L. IVANOVII AI-INLFE. 103
6.2 ARBEITEN MIT RNA. 103
6.2.1 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON RNA. 103
6.2.2 ISOLIERUNG VON RNA AUS LISTERIA SPP. 103
6.2.3 NORTHERN BLOT. 104
6.2.4 PRIMER EXTENSION. 104
6.2.5 RT-PCR. 106
6.3 ARBEITEN MIT PROTEINEN. 106
6.3.1 ISOLATION VON PROTEINEN AUS
LISTERIA SPP. 106
6.3.1.1 ANZUCHTBEDINGUNGEN. 106
6.3.1.2 UEBERSTANDSPROTEINE. 106
6.3.1.3 OBERFLAECHENPROTEINE. 107
6.3.2 "MEM-SHIFT" UND [35S]-L-METHIONIN-MARKIERUNG VON PROTEINEN. 107
INHALTSVERZEICHNIS
6.3.3 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE(SDS-PAGE). 107
6.3.4 ZWEIDIMENSIONALE (2-D-) GELELEKTROPHORESE. 109
6.3.5 FPLC. 111
6.3.6 PROTEIN-MIKROSEQUENZIERUNG.111
6.4 WEITERE METHODEN.LLL
6.4.1 KULTUR UND INFEKTION VON EUKARYONTISCHEN ZELLEN. 111
6.4.1.1 CACO-2-ZELLEN. 111
6.4.1.2 J774-ZELLEN. 112
6.4.2 INFEKTION VON C57BL/6-MAEUSEN. 112
6.4.2.1 BESTIMMUNG DES LD50-WERTES. 112
6.4.2.2 BAKTERIENZAHLEN IN MILZ UND LEBER. 112
OE.4.2.3 HISTOLOGIE. 113
6.4.3 COMPUTERANALYSEN VON DNA- UND PROTEINSEQUENZEN.113
7 LITERATUR. 114
8 ANHANG.123
8.1 ABKUERZUNGEN. 123
8.2 DER GENETISCHE STANDARDCODE. 125
8.3 NUKLEOTIDSEQUENZEN.125
8.3.1 DIE M/C-REGION VON
L. MONOCYTOGENES. 125
8.3.2 DIE I-M/DC-REGION VON
L. IVANOVII. 127
8.3.3 DIE I-IN/FE-REGION VON
L. IVANOVII. 131
8.4 PUBLIKATIONSLISTE.133
8.5 LEBENSLAUF.134
8.6 SUMMAIY.135 |
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