Untersuchungen zu RS1, einem Regulator von Plasmamembrantransportern: Studien an Oozyten, Zellkulturen und transgenen Mäusen
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| Format: | Buch |
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1999
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INHALTSVERZEICHNIS
I
1 ZUSAMMENFASSUNG. 1
2
EINLEITUNG.3
2.1 TRANSPORT UEBER DIE
PLASMAMEMBRAN.3
2.2 REGULATION VON PLASMAMEMBRANTRANSPORTERN.3
2.3 REGULATION DES NA+-D-GLUKOSE KOTRANSPORTERS SGLT1.4
2.3.1 REGULATION IM DARM.5
2.3.2 REGULATION IN KULTIVIERTEN LLC-PKPZELLEN. 6
2.3.3 REGULATION IN OOZYTEN. 7
2.4 SYSTEME ZUR CHARAKTERISIERUNG VON TRANSPORTPROTEINEN.8
2.4.1 DAS XENOPUS LAEVIS OOZYTENSYSTEM.8
2.4.2 ZELLKULTURSYSTEME.9
2.4.3 TRANSGENE TIERE.10
2.5 DAS RSL-PROTEIN. 11
2.6 AUFGABENSTELLUNG.12
3 MATERIAL UND METHODEN. 14
3.1 MIKROBIOLOGISCHE MATERIALIEN UND METHODEN.14
3.1.1 BAKTERIENMEDIEN.14
3.1.2 BAKTERIENANZUCHT.14
3.1.3 DAUERKULTUREN.14
3.1.4 HERSTELLUNG KOMPETENTER E. COLI ZELLEN FUER DIE ELEKTROPORATION.15
3.1.5 TRANSFORMATION ELEKTROKOMPETENTER ZELLEN.15
3.1.6 INDUKTION DES E. COLI EXPRESSIONSSTAMMES BL21 [DE3]
ZUR UEBEREXPRESSION DES REKOMBINANTEN PRSL -PROTEINS.15
3.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN.16
3.2.1 OLIGONUKLEOTIDE.16
3.2.2 ISOLIERUNG VON NUKLEINSAEUREN.17
3.2.2.1 PLASMIDPRAEPARATION AUS BAKTERIEN DURCH ALKALISCHE LYSE.17
3.2.2.2 PLASMIDPRAEPARATION IM QUANTITATIVEN MASSSTAB.17
3.2.2.3 ISOLIERUNG GENOMISCHER DNA AUS TIERISCHEM GEWEBE UND ZELLEN.18
3.2.2.4 ISOLIERUNG VON GESAMT-RNA AUS TIERISCHEM GEWEBE UND ZELLEN.18
3.2.2.5 ISOLIERUNG VON POLY(A)+-RNA.19
3.2.3 REINIGUNG VON DNA DURCH CSCL-DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION.20
3.2.4 ANALYSE VON NUKLEINSAEUREN.21
3.2.4.1 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DNA UND RNA.21
3.2.4.2 AGAROSEGELELEKTROPHORESE VON DNA.21
3.2.4.3 AGAROSEGELELEKTROPHORESE VON DENATURIERTER RNA.21
3.2.4.4 SEQUENZIERUNG VON DNA MIT DER T7 DNA-POLYMERASE.22
3.2.4.5 SEQUENZIERUNG VON DNA MIT DER TAQ-POLYMERASE.22
3.2.4.6 DENATURIERENDE POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE.23
3.2.4.7 SOUTHEM-TRANSFER.23
3.2.4.8 KOLONIEHYBRIDISIERUNG.24
3.2.4.9 NORTHEM-TRANSFER.25
3.2.4.10 SOUTHEM-HYBRIDISIERUNG.25
3.2.4.11 NORTHEM-HYBRIDISIERUNG.26
3.2.5 MODIFIKATION VON NUKLEINSAEUREN.26
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/957795025
INHALTSVERZEICHNIS
II
3.2.5.1 RESTRIKTION VON DNA.26
3.2.5.2 MODIFIKATION VON DNA MIT DER EXONUCLASE BAL31.27
3.2.5.3 MODIFIKATION VON DNA MIT DEM KLENOW-FRAGMENT.27
3.2.5.4 MODIFIKATION VON DNA MIT DER T4 DNA-POLYMERASE.27
3.2.5.5 PHOSPHORYLIERUNG DURCH DIE T4 POLYNUKLEOTIDKINASE.28
3.2.5.6 DEPHOSPHORYLIERUNG DURCH DIE ALKALISCHE PHOSPHATASE.28
3.2.5.7 LIGAUEON VON DNA.28
3.2.5.8 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN
DURCH PRIMAVERLAENGERUNG.29
3.2.5.9 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON OLIGONUKLEOTID-SONDEN
DURCH ENDMARKIERUNG.29
3.2.5.10 POLYMERASE-KETTENREAKTION. 29
3.2.5.11 REVERSE-TRANSKRIPTASE-PCR.30
33 PROTEINCHEMISCHE METHODEN.31
3.3.1 ISOLIERUNG EINES REKOMBINANTEN PROTEINS AU
SE. COLI.31
3.3.1.1 ANREICHERUNG UND AUFSCHLUSS DER YYINCLUSION BODIES".31
3.3.1.2 REINIGUNG DA AUFGESCHLOSSENEN YYINCLUSION BODIES" AN DER NI-NT
A-
AFFINITAETSMATRIX.32
3.3.2 DIFFERENTIELLE FRAKTIONIERUNG VON
XENOPUS LAEVIS OOZYTEN.33
3.3.3 DIFFERENTIELLE FRAKTIONIERUNG VON EUKARYONTISCHEN ZELLEN.34
3.3.4 EINFACHE FRAKTIONIERUNG VON GEWEBE.34
3.3.5 PROTEINBESTIMMUNGEN.35
3.3.5.1 PROTEINBESTIMMUNG NACH LOWRY.35
3.3.5.2 PROTEINBESTIMMUNG NACH BRADFORD.35
3.3.6 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE.36
3.3.7 ELEKTROTRANSFER VON PROTEINEN AUS SDS-POLYACRYLAMID-GELEN.37
3.3.8 PONCEAU-S-FAERBUNG VON MEMBRANGEBUNDENEN PROTEINEN.37
3.3.9 WESTEM-BLOT-DETEKTIONEN.37
3.3.10 AFFINITAETSREINIGUNG VON REKOMBINANTEN PROTEIN-ANTIKOERPERN.38
3.3.11 AFFINITAETSREINIGUNG VON PEPTIDANTIKOERPEM.39
3.3.12 BESTIMMUNG DA ANTIKOERPERKONZENTRATION DURCH DOT-BLOT.39
3.4 ZELLKULTURTECHNIKEN.40
3.4.1 ANZUCHTBEDINGUNGEN.40
3.4.2 ZELLZAHLBESTIMMUNG.41
3.4.3 ANLEGEN VON KIYOKULTUREN.41
3.4.4 HERSTELLUNG VON STABIL TRANSFIZIERTEN ZELLINIEN.41
3.4.5 TRANSPORTMESSUNGEN AN ZELLSUSPENSIONEN.42
4
ERGEBNISSE.-*.44
4.1 LOKALISATION VON RS1 IM ZELLKERN.44
4.1.1 UNTERSUCHUNGEN AN OOZYTEN.44
4.1.2 UNTERSUCHUNGEN AN GFP-RS1 TRANSFIZIERTEN LLC-PKI-ZELLEN.47
4.1.2.1 HERSTELLUNG EINER STABIL TRANSFIZIERTEN GFP-RS 1 -ZELLINIE.47
4.1.2.2 ZELLULAERE LOKALISATION DES GFP-RS 1 -FUSIONSPROTEINS.49
4.1.3 LOKALISATION DES RS 1 -PROTEINS IN NATIVEN LLC-PKI-ZELLEN.53
4.2 UNTERSUCHUNGEN ZUR FUNKTION VON RS1.55
4.2.1 UNTERSUCHUNGEN AN INDUZIERBAREN ANTISENSE RS 1 LLC-PKI ZELLEN.56
4.2.2 UNTERSUCHUNGEN AN ANTISENSE RS1 A293 ZELLEN.58
4.2.3 UNTERSUCHUNGEN AN SENSE GFP-RS 1 ZELLEN.60
INHALTSVERZEICHNIS
III
4.3 ERZEUGUNG VON RS1 KNOCK-OUT MSUSEN UND ERSTE
CHARAKTERISIERUNGEN.61
4.3.1 KLONIERUNG DES RS 1-GENS AUS DER MAUS.62
4.3.2 ERSTELLUNG EINER RESTRIKTIONSKARTE DES RS 1-GENS IM
120 KB BAC-INSERTIONSFIRAGMENT.63
4.3.3 SEQUENZANALYSE DES RS 1 -GENS.64
4.3.4 HERSTELLUNG EINES VEKTORKONSTRUKTES ZUR ERZEUGUNG VON
RS1 KNOCK-OUT MAEUSEN.65
4.3.5 METHODEN ZUR TYPISIERUNG VON EMBRYONALEN STAMMZELLEN UND MAEUSEN69
4.3.5.1 GENOMISCHE SOUTHEM-BLOT HYBRIDISIERUNG.69
4.3.5.2 GENOMISCHE PCR.71
4.3.5.3 NORTHEM-BLOT HYBRIDISIERUNG.73
4.3.6 UNTERSUCHUNGEN DER TRANSGENEN MAEUSE.74
4.3.6.1 VERAENDERUNGEN VON PLASMAMEMBRANTRANSPORTEM AUF MRNA-EBENE.74
4.3.6.2 VERAENDERUNGEN DER SGLT1 -PROTEINMENGE IN DER NIERE.76
5 DISKUSSION. 79
5.1 NACHWEIS VON RS1 IM ZELLKERN. 79
5.2 FUNKTIONELLE UNTERSUCHUNGEN DES RSL-PROTEINS.83
53 DIE RS1 KNOCK-OUT MAUS
.84
5.4 LAESST SICH DIE LOKALISATION VON RS1 MIT
SEINER STRUKTUR
VEREINBAREN?._85
5.5 LOKALISATION UND FUNKTION VON RS1
.87
5.6
AUSBLICK.89
6
LITERATURVERZEICHNIS.91
7 ANHANG. 100
7.1 ABKFIRZUNGSVERZEICHNIS.100
7.2 DIE NUKLEINSAEURESEQUENZ VON MAUS-RSL.102
7.3 DIE NUKLEINSAEURESEQUENZ DES MONIERTEN MAUS-SGLTL-
FRAGMENTS ZUR HERSTELLUNG EINES PEPTIDANTIKOERPERS.103
7.4 GENOMISCHE RESTRIKTIONSANALYSE UND SOUTHERN-HYBRIDISIERUNG
DES
MAUS-RSL-GENBEREICHES._.
104
7.5 ROLLE DES HOCHKONSERVIERTEN RS1 C-TERMINUS BEI DER
MEMBRANASSOZIATION.
107 |
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