Klonierung, Sequenzierung und Homologieanalyse der pyrophosphatabhängigen Phosphofructokinase aus Kartoffeln:
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| Format: | Buch |
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1999
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG_1
1.1. REAKTION UND EINTEILUNG DER PHOSPHOFRUCTOKINASEN_1
1.2. DIE PP,-ABHAENGIGE PFK_3
1.3. DIE ROLLE DER PYROPHOSPHATABHAENGIGEN PHOSPHOFRUCTOKINASE IN
PFLANZEN 4
1.4. DIE PPJ-PFK AUS KARTOFFELN_7
2. AUFGABENSTELLUNG_ 9
3. MATERIAL UND METHODEN_ 10
3.1. MATERIALIEN_ 10
3.1.1. CHEMIKALIEN_10
3.1.2. ENZYME UND DNA-LAENGENSTANDARDS_11
3.1.3. KITS FUER DIE MOLEKULARBIOLOGIE_12
3.1.4. OLIGONUCLEOTIDE_12
3.1.5. PLASMIDE_ 13
3.1.6. BAKTERIEN_14
3.1.7. HAEUFIG VERWENDETE LOESUNGEN_14
3.1.8. VERWENDETE SOFTWARE_14
3.2. METHODEN_ 16
3.2.1. ALLGEMEINE NUCLEINSAEURE-TECHNIKEN_16
3.2.1.1. QUANTIFIZIERUNG VON DNA UND RNA_ 16
3.2.1.2. PHENOLEXTRAKTION VON PROTEINEN UND PRAEZIPITATION VON
NUCLEINSAEUREN 16
3.2.1.3. REINIGUNG VON NUCLEINSAEUREN_ 17
3.2.1.4. ELEKTROPHORETISCHE TRENNUNG VON DNA-FRAGMENTEN_17
3.2.2. KLONIERUNG DER PP,-PFK-UNTEREINHEITEN_18
3.2.2.1. RNA-PRAEPARATION_18
3.2.2.2. PCR-METHODEN_18
3.2.2.21. RT-PCR_ 18
3.2.2.2.2. PCR ZUR UMKLONIERUNG DER A-UNTEREINHEIT AUS PUC 19 IN
PQE31_19
3.2.2.2.3. PCR ZUR ORTSGERICHTETEN MUTAGENESE DER SS-UNTEREINHEIT_19
3.2.2.2.4. PCR-SCREENING_20
3.2.2.3. SPALTUNG MIT RESTRIKTIONSENDONUCLEASEN_20
3.2.2.4. MODIFIKATION VON DNA-ENDEN_20
3.2.2.5. LIGATION MIT T4-DNA-LIGASE_ 21
3.2.2.6. KOMPETENTE ZELLEN_ 21
3.2.2.7. TRANSFORMATION_ 22
3.2.2.8. PRAEPARATION VON PLASMID-DNA _ 23
3.2.2.9. DNA-SEQUENZIERUNG_23
3.2.3. EXPRESSIONSSTUDIEN UND PROTEINTECHNIKEN_25
3.2.3.1. KULTIVIERUNGSTECHNIKEN _25
3.2.3 2. INDUKTION DER EXPRESSION MIT IPTG_25
3.2.3.3. EXTRAKTGEWINNUNG_25
3.2.3.3.1. ZELLAUFSCHLUSS MIT ULTRASCHALL_25
3.2.3.3.2. ZELLAUFSCHLUSS MIT DENATURANTIEN_ 26
3.2.3.4. CHROMATOGRAPHISCHE PROTEINREINIGUNG UEBER NI-NTA-SAEULEN_26
3.2.3.5. PROTEINQUANTIFIZIERUNG_26
3.2.3.6. SDS-POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE_27
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/956328814
3.2.3.7. WESTERN-BLOT-ANALYSE_28
3.2.3.7.1. SPEZIFISCHE ANTI-PP,-PFK ANTIKOERPER_28
3
.
23
.
1
.
2
.
WESTERN-BLOT_28
3.2.3.7.3. NI-NTA-AP-KONJUGAT_29
4. ERGEBNISSE_30
4.1. KLONIERUNG DER PPJ-PFK_30
4.1.1. RT-PCR-REAKTION_30
4.1.1.1. A-UNTEREINHEIT_30
4.1.1.2. SS-UNTEREINHEIT_32
4.1.2. LIGATION UND TRANSFORMATION_33
4.1.3. CHARAKTERISIERUNG DER PLASMIDE_ 34
4.1.3.1. SCREENING-METHODEN_34
4.1.3.2. RESTRIKTIONSANALYSE_35
4.1.3.2.1. A-UNTEREINHEIT_35
4.1.3.2.2. SS-UNTEREINHEIT_37
4.1.3.3. SEQUENZANALYSE_ 38
4.1.3.3.1. A-UNTEREINHEIT_38
4.1.3.3.2. SS-UNTEREINHEIT_ 40
4.1.4. MUTAGENESE DER SS-UNTEREINHEIT_41
4.2. KONSTRUKTION DER EXPRESSIONSVEKTOREN _ 44
4.2.1. PUC-DERIVATE_45
4.2.1.1. A-UNTEREINHEIT ENTHALTENDE PUC-DERIVATE_ 45
4.2.1.2. SS-UNTEREINHEIT ENTHALTENDE PUC-DERIVATE_ 48
4.2.2. PQE-DERIVATE_49
4.2.2.1. A-UNTEREINHEIT ENTHALTENDE PQE-DERIVATE_49
4.2.2.2. SS-UNTEREINHEIT ENTHALTENDE PQE-DERIVATE_49
4.2.3. A- UND SS-UNTEREINHEIT ENTHALTENDE PLASMIDE_ 51
4.3. EXPRESSION UND NACHWEIS REKOMBINANTER PPJ-PFK_52
4.3.1. PROTEINREINIGUNG DURCH AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE _52
4.3.2. NACHWEIS DER REKOMBINANTEN PPJ-PFK IM WESTERN BLOT_53
4.3.3. EXPRESSIONSUNTERSUCHUNGEN_54
4.3.4. ELEKTRONENMIKROSKOPIE_57
5. DISKUSSION_60
5.1. KLONIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER PP,-PFK-UNTEREINHEITEN_60
5.2. EXPRESSIONSUNTERSUCHUNGEN_61
5.3. IDENTIFIKATION KONSERVIERTER AMINOSAEUREN DURCH
HOMOLOGIEVERGLEICH_68
5.3.1. VERGLEICH DER ATP / ADP-BINDUNGSSTELLE_71
5.3.2. VERGLEICH DER F-6-P / F-L6-P2 BINDUNGSSTELLE_75
5.3.3. DAS AKTIVE ZENTRUM_ 79
5.3.4. DIE F-2,6-P2-BINDUNGSSTELLE_80
5.4. AUSBLICK AUF FORTFUEHRENDE EXPERIMENTE_82
5.5. VERGLEICH DER DOMAENENSTRUKTUR_83
5.6. SEQUENZKORREKTUR DER SS-UNTEREINHEIT DER PPJ-PFK_88
6. ZUSAMMENFASSUNG _89
7. LITERATURVERZEICHNIS_ 92 |
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