Die Untersuchung der Expressionsregulation von myeloisch-monozytär spezifischen Genen:
Gespeichert in:
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1998
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Beschreibung: | Münster (Westfalen), Univ., Diss., 1999 |
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INHALTSVERZEICHNIS
IV
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
IV
1 EINLEITUNG.
1.1 MRP8 UND MRP14.
1.1.1 ENTDECKUNG VON MRP14 UND MRP8.
1.1.2 S1 OO-PROTEINE.
1.1.3 EXPRESSION VON MRP8 UND MRP 14.
1.1.3.1 EXPRESSION IN VERSCHIEDENEN ZELLINIEN.
1.1.4 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG VON MRP8 UND MRPI4.
1.1.5 BESCHRIEBENE FUNKTIONEN.
1.1.6 ERKRANKUNGEN IM ZUSAMMENHANG MIT MRP8 UND MRP 14
1.1.7 REGULATION DER EXPRESSION VON MRP8 UND MRP! 4.
1.1.8 TRANSKRIPTIONSFAKTOREN UND MRP14.
1.2 ZIELSETZUNG DER ARBEIT.
.
1
.
2
.2
.3
.
5
.6
.
7
.
7
.
)
10
1 I
16
2
MATERIAL UND METHODEN.
2.1 MATERIAL.
2.1.1 ORGANISMEN.
2.1.1.1 BAKTERIENSTAEMME.
2.1.1.2 ZELLINIEN.
2.1.2 NUKLEINSAEUREN.
2.1.2.1 LAENGENSTANDARDS.
2.1.2.2 PLASMIDE.
2.1.2.3 OLIGONUKLEOTIDE.
2.1.3 ENZYME.
2.1.4 KULTURMEDIEN.
2.1.4.1 NAEHRMEDIEN FUER BAKTERIEN.
2.1.4.2 MEDIEN FUER DIE ZELLKULTUR.
2.1.5 GERAETE UND VERBRAUCHSMATERIAL.
2.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE TECHNIKEN.
2.2.1 HERSTELLUNG KOMPETENTER
E.
CO//-BAKTERIEN
2.2.2 TRANSFORMATION.
2.2.3 PLASMIDISOLIERUNG AUS
E
.CO//-BAKTERIEN.
2.2.3.1 DNA-MINIPRAEPARATION.
. 17
.
17
.
17
.
17
.
17
.
18
.
18
.
18
. 19
19
19
19
20
20
21
21
22
22
22
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
V
2
.2.3.2 DNA-MAXIPRAEPARATION. 23
2
.2.3.3 DNA-MAXIPRAEPARATION MIT IONENAUSTAUSCHERSAEULEN.24
2.2.4 ENZYMATISCHE MODIFIKATION VON DNA. 24
2.2.4
.1 RESTRIKTION. - 4
2.2.4.2 PARTIELLE RESTRIKTION.
25
2.2.4.3 DEPHOSPORYLIERUNG. 26
2.2.4.4 UNIDIREKTIONALE DELETION. 26
2.2.4.5 LIGATION.
27
2.2.5 AGAROSEGELELEKTROPHORESE.
27
2.2.6 ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN. 29
2.2.6.1 ISOLIERUNG VON DNA AUS AGAROSEGELEN.29
2.2.6.2 ISOLIERUNG VON DNA AUS POLYACRYLAMIDGELEN.29
2.2.7 POLYMERASE-KETTENREAKTION.
30
2.2.8 DNA-SEQUENZIERUNG.
2.2.9 MARKIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN. 32
2.2.9
.1 ENDMARKIERUNG MITTELS T4-POLYNUKLEOTIDKINASC.32
2.2.92
ENDMARKIERUNG MITTELS KLENOW-FRAGMENT.33
2.2.9.3
RANDOM-PRIMINGMIT DIGOXIGENIN.33
2.2.10 RNA-ISOLIERUNG.
34
2.2.1
1 NORTHERN-B\OT.35
2.2.12 ELEKTROPORATION.36
2.3 ZELLKULTUR.
38
2.3.1 KULTIVIERUNG VON ZELLINIEN.38
2.3.1.1 HL-60.38
2.3.1.1.1 STIMULATION VON HL-60-ZELLEN.38
2.3.1.2 MONOMAC
-6.39
2.3.1.3 U-937.39
2.3.1.4 L-132.39
2.3.2 ISOLIERUNG VON BLUTZELLEN.40
2.3.2.1 AUFARBEITUNG UND KULTIVIERUNG VON MONOZYTEN.40
2.3.2.2 STIMULATION VON MONOZYTEN.41
2.3.2.3 ISOLIERUNG VON GRANULOZYTEN.42
2.4 PROTEINCHEMISCHE METHODEN.
43
2.4.1 NACHWEIS DER GENEXPRESSION.
43
2.4.1.1 HERSTELLUNG VON PROTEINEXTRAKTEN.
43
2.4.1.2 CAT-ASSAY.44
2.4.2 HERSTELLUNG VON KEMPROTEINEXTRAKTEN. 45
INHALTSVERZEICHNIS Y
2.4.2.1 HOCHSALZELUTION. 45
2.4.2.2 ULTRAZENTRIFUGATIONSMETHODE.
2.4.3 GELRETENTIONSANALYSE (EMSA).
47
2.4.4 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE. 49
2.4.5 DETEKTION VON PROTEINEN.
2.4.5.1 SILBERFARBUNG.
2.4.5.2 COOMASSIE-BRILLANT-BIUE FAERBUNG. 5]
2.4.6 PROTEINBLOT. ^ I
2.4.7 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON PROTEINEXTRAKTEN. 52
2.4.8 UV-QUERVEMETZUNG VON PROTEINEN MIT DNA.52
2.4.9 ISOLIERUNG VON DNA-BINDENDEN PROTEINEN MIT MAGNETOBEADS.53
2.4.10
WESTERN-BLOT. 55
2.4.11 IMMUNHISTOLOGIE.
^
3 ERGEBNISSE.
5S
3.1 KLONIERUNG DER EXPRESSIONSVEKTOREN. 5G
3.1.1 KLONIERUNG DES CAT-REPORTERVEKTORS. 5G
3.1.2 HERSTELLUNG DER DELETIONSKONSTRUKTE DES PROMOTORS.59
3.1.3 SEQUENZANALYSE DER DELETIONSKONSTRUKTE. 59
3.2 UNTERSUCHUNG DER GENEXPRESSION IN EUKARYOTISCHEN ZELLINIEN.60
3.2.1 KONTROLLE DER GENEXPRESSION. 60
3.2.2 ERMITTLUNG DER TRANSFEKTIONSBEDINGUNGEN. 62
3.2.3 VERGLEICH DER EXPRESSION DES MRP14-PROMOTORS IN DEN ZELLINIEN.63
3.2.4 TRANSFEKTION IN MONOMAC-6- UND HL-60+DMSO-ZELLEN.64
3.3 IDENTIFIKATION VON ELEMENTEN, DIE AN DIE -400 BP REGION BINDEN.65
3.3.1 DATENBANKANALYSE.65
3.3.2 GELRETENTIONSANALYSE DES MRP-EXPRESSIONSTEIGEMDEN ELEMENTS.67
3.3.3 UNTERSUCHUNG DER SPEZIFITAET DER GEBUNDENEN KOMPLEXE.68
3.3.4 GELRETENTIONSANALYSE MIT LYMPHOZYTEN.69
3.3.5 GELRETENTIONSANALYSE MIT MONOZYTEN.71
3.3.6
NORTHERN-BLOT MIT MONOZYTEN.73
3.4 FUNKTIONELLE UNTERSUCHUNG DER EIGENSCHAFTEN DES MEE.74
3.4.1 KLONIERUNG DES MEE.74
3.4.2 FUNKTIONELLE ANALYSE DES MEE.74
3.5 IDENTIFIKATION DER AN DAS MEE BINDENDEN PROTEINE.76
3.5.1 DNA-PROTEIN-UV-QUERVEMETZUNG MIT DEM MEE.76
3.5.2 AFFINITAETSAUFREINIGUNG.77
INHALTSVERZEICHNIS
VII
3.5.3 GELRETENTIONSANALYSE MIT DEN PROTEINEN DER
AFFINITAETSAUFREINIGUNG.78
3.5.4 PROTEINSEQUENZIERUNG.
79
3.6 EINFLUSS VON MNDA AUF DEN MRP14-PROMOTOR.
79
3.6.1 GELRETENTIONSANALYSE MIT MNDA.
79
3.6.2 GELRETENTIONSANALYSE MIT MNDA-ANTIKOERPER.
79
3.6.3 KOTRANSFEKTION MIT EINEM MNDA-EXPRESSIONSVEKTOR. 80
3.6.4
WESTERN-BLOT MIT DEM MNDA-ANTIKOERPER. 8,
4 DISKUSSION.
.82
4.1 ANALYSE DES HUMANEN MRP14-PROMOTORS.
82
4.2 PROTEINBINDUNG AN DAS MRP-EXPRESSIONSTEIGEMDC ELEMENT (MEE). 86
4.3
FUNKTIONELLE UNTERSUCHUNG DES MEE. 89
4.4 CHARAKTERISIERUNG DER BINDENDEN PROTEINE. 90
4.5 EINFLUSS VON MNDA AUF DAS MEE.
91
4.6
AUSBLICK. .
.
5 ZUSAMMENFASSUNG.
.97
6 LITERATURVERZEICHNIS.
99 |
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