Klonierung, heterologe Expression, Reinigung und Charakterisierung einer induzierbaren O-Methyltransferase des Benzylisochinolin- und Phenylpropanoidstoffwechsels aus Thalictrum tuberosum L.:
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1999
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INHALTSVERZEICHNIS
V
INHALTSVERZEICHNIS
I.
EINLEITUNG
1
II.
MATERIAL
.
31
1.
ZELLKULTUREN
.
YY
.
31
1.1
PFLANZLICHE
ZELLSUSPENSIONSKULTUREN
.
31
1.2
BAKTERIENSTAEMME
.
31
1.3
INSEKTENZELLEN
.
YY32
2.
MEDIEN
.
33
3.
NUKLEINSAEUREN
UND
NUKLEOTIDE
.
34
4.
ENZYME
UND
ENZYMKITS
.
36
5.
CHEMIKALIEN
37
6.
SONSTIGES
38
7.
GERAETE
.
.39
UI.
METHODEN
43
1.
ELICITIERUNG
VON
THALICTRUM
TUBEROSUM
L.
SUSPENSIONSKULTUREN
43
1.1
ELICITIERUNG
IN
MULTISCHALEN
.
43
1.2
ELICITIERUNG
IN
KOLBEN
.
44
2.
GEWINNUNG
ZELLFREIER
ENZYMPRAEPARATIONEN
AUS
THALICTRUM
TUBEROSUM
L.
SUSPENSIONSKULTUR
44
3.
ENZYMTESTS
.
45
3.1
METHYLTRANSFERASE-STANDARDTEST
45
3.2
SAM:(R,S)-NORCOCLAURIN-6-O-METHYLTRANSFERASE
.
45
3.3
SAM:(R,S)-COCLAURIN-N-METHYLTRANSFERASE
.
46
3.4
SAM:(S)-3'-HYDROXY-N-MEYLCOCLAURIN-4'-O-METHYLTRANSFERASE
46
3.5
SAM:(S)-SCOULERIN-9-O-METHYLTRANSFERASE
47
3.6
BERBERINBRUECKENENZYM
(BBE)
48
3.7
(S)-TETRAHYDROPROTOBERBERINOXIDASE
(STOX)
.
49
4.
ENZYMATISCHE
SYNTHESE
UND
REINIGUNG
VON
KAFFEOYL-COA
.
49
5.
CHROMATOGRAPHISCHE
METHODEN
50
5.1
DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE
.
50
5.2
HOCHAUFLOESENDE
FLUESSIGKEITSCHROMATOGRAPHIE
(HPLC)
51
5.3
LONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
AN
DEAE
SEPHACEL
.
52
5.4
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
53
5.4.1
SYNTHESE
VON
SAH-SEPHAROSE
4B
.
53
5.4.2
CHROMATOGRAPHIE
MIT
SAH-SEPHAROSE
4B
.
53
5.5
GELPENNEATIONSCHROMATOGRAPHIE
.
54
6.
ISOLIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
55
VI
INHALTSVERZEICHNIS
6.1
ISOLIERUNG
VON
RNA
55
6.1.1
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
AUS
PFLANZENSUSPENSIONSKULTUREN
55
6.1.2
ISOLIERUNG
VON
POLY(A)
+
-RNA
AUS
GESAMT-RNA
.
57
6.2
ISOLIERUNG
VON
DNA
57
6.2.1
ISOLIERUNG
VON
GENOMISCHER
DNA
AUS
PFLANZENSUSPENSIONSKULTUREN
_
_
57
6.2.2
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
BAKTERIEN
59
6.2.3
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
.
.60
7.
ENZYMATISCHE
MODIFIKATIONEN
VON
NUKLEINSAEUREN
61
7.1
RESTRIKTIONSANALYSEN
61
7.2
LIGATIONEN
.
61
7.3
REVERSE
TRANSKRIPTION
62
8.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
YY63
8.1
ENDMARKIERUNG
SYNTHETISCHER
OLIGONUKLEOTIDE
.
63
8.2
MARKIERUNG
VON
DNA
MIT
DEM
RANDOM
PRIMERS
LABELING
SYSTEM
64
9.
TRANSFER
VON
DNA
UND
RNA
AUF
NYLONMEMBRANEN
(BLOTTING)
.
65
9.1
NORTHEM-BLOTTING
65
9.2
SOUTHEM-BLOTTING
.
66
10.
HYBRIDISIERUNGSTECHNIKEN
.
66
10.1
HYBRIDISIERUNG
MIT
OLIGONUKLEOTIDEN
.
66
10.2
HYBRIDISIERUNG
MIT
DNA-PROBEN
.
.
68
10.3
ENTFERNUNG
DER
HYBRIDISIERTEN
SONDEN
.
69
11.
GELELEKTROPHORESEN
.
69
11.1
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
.
69
11.1.1
DNA-ANALYSEN
69
11.1.2
RNA-ANALYSEN
.
70
11.2
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
.
71
11.2.1
SEQUENZGELELEKTROPHORESE
.
.
71
11.2.2
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
.
73
11.3
FAERBEN
VON
PROTEINGELEN
.
74
11.3.1
FAERBUNG
MIT
COOMASSIE-BLAU
.
74
11.3.2
SILBERFAERBUNG
.
.
75
12.
HERSTELLUNG
UND
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
ZELLEN
.
76
12.1
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ZELLEN
76
12.2
TRANSFORMATION
VON
KOMPETENTEN
ESCHERICHIA
COLI
77
13.
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
77
14.
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
.
79
15.
KONSTRUKTION
UND
DURCHMUSTERUNG
EINER
CDNA-BIBLIOTHEK
IN
Z-PHAGEN
80
15.1
KONSTRUKTION
UND
VERPACKUNG
EINER
X
ZAP
II-BIBLIOTHEK
.
80
INHALTSVERZEICHNIS
VII
15.2
DURCHMUSTERUNG
EINER
X
ZAP
II-BIBLIOTHEK
(SCREENING)
.
82
15.3
AUSSCHNEIDEN
DES
PBLUESCRIPT
SK
(-)
PHAGMIDS
AUS
DEM
UNI-ZAPYY
XR-VEKTOR
(IN
VRVO-EXCISION)
.
83
16.
PROTEINEXPRESSION
IN
INSEKTENZELLEN
84
16.1
GEWINNUNG
REKOMBINANTER
BACMID-DNA
MIT
DEM
BAC-TO-BACYY
BACULOVIRUS
EXPRESSION
SYSTEM
.
84
16.2
TRANSFEKTION
VON
SPODOPTERA
FRUGIPERDA
SF9
ZELLEN
MIT
REKOMBINANTER
BACMID-DNA
.
85
16.3
KULTIVIERUNG
UND
INFEKTION
VON
SPODOPTERA
FRUGIPERDA
SF9
ZELLEN
.
87
16.4
AMMONIUMSULFATFAELLUNG
ZUR
GEWINNUNG
ZELLFREIER
EXTRAKTE
FUER
DIE
PROTEINREINIGUNG
DER
HETEROLOG
EXPRIMIERTEN
O-METHYLTRANSFERASEN
88
17.
KONZENTRATIONSBESTIMMUNGEN
.
88
17.1
PROTEINGEHALTSBESTIMMUNGEN
88
17.2
NUKLEINSAEUREGEHALTSBESTIMMUNGEN
.
89
18.
RADIOAKTIVITAETSBESTIMMUNGEN
89
19.
COMPUTERANALYSEN
UND
DATENBANKVERGLEICHE
90
IV.
ERGEBNISSE
91
1.
VERGLEICHENDE
UNTERSUCHUNGEN
EINER
BERBERIN-PRODUZIERENDEN
UND
EINER
BERBERIN-FREIEN
ZELLINIE
VON
THALICTRUM
TUBEROSUM
91
1.1
VERGLEICH
DER
WEISSEN
UND
GELBEN
ZELLINIE
VON
THALICTRUM
TUBEROSUM
91
1.1.1
CHARAKTERISIERUNG
BEIDER
STAEMME
.
92
1.1.2
AKTIVITAETSBESTIMMUNG
EINIGER
AN
DER
BERBERINBIOSYNTHESE
BETEILIGTER
ENZYME
IN
DER
WEISSEN
UND
GELBEN
ZELLINIE
VON
THALICTRUM
TUBEROSUM
_
97
1.1.3
APPLIKATION
VON
(S)-RETIKULIN
UND
(S)-SCOULERIN
AN
DIE
WEISSE
ZELLINIE
VON
THALICTRUM
TUBEROSUM
98
1.2
ELICITIERBARKEIT
DER
WEISSEN
UND
GELBEN
ZELLINIE
VON
THALICTRUM
TUBEROSUM,
101
1.2.1
ERMITTLUNG
DES
OPTIMALEN
ELICITIERUNGSZEITPUNKTS
IM
SUBKULTIVIERUNGS
ZYKLUS
VON
THALICTRUM
TUBEROSUM
.
101
1.2.1.1
ELICITIERUNG
DER
GELBEN
ZELLINIE
MIT
METHYLJASMONAT
UND
EINEM
HEFEELICITOR
.
101
1.2.1.2
ELICITIERUNG
DER
WEISSEN
ZELLINIE
MIT
METHYLJASMONAT
UND
EINEM
HEFEELICITOR
.
.
103
1.2.2.
ERMITTLUNG
DER
OPTIMALEN
ELICITORKONZENTRATION
FUER
THALICTRUM
TUBEROSUM
105
1.2.2.1
OPTIMALE
ELICITORKONZENTRATION
FUER
DIE
GELBE
ZELLINIE
.
106
1.2.2.2
OPTIMALE
ELICITORKONZENTRATION
FUER
DIE
WEISSE
ZELLINIE
.
110
1.2.3
AUSWAHL
DER
GEEIGNETEN
ZELLINIE
UND
DES
OPTIMALEN
ELICITORS
ZUR
SUBKLONIERUNG
DER
METHYLTRANSFERASEGENE
.
112
1.2.4
KINETISCHE
UNTERSUCHUNGEN
DER
GELBEN
ZELLINIE
VON
THALICTRUM
TUBEROSUM
_
114
VIN
INHALTSVERZEICHNIS
1.2.4.1
KINETISCHE
UNTERSUCHUNGEN
EINIGER
AN
DER
BERBERINBIOSYNTHESE
BETEILIGTER
ENZYME
NACH
ELICITIERUNG
MIT
METHYLJASMONAT
.
115
1.2.4.2
KINETISCHE
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
ALKALOIDPRODUKTION
NACH
ELICITIERUNG
MIT
METHYLJASMONAT
.
117
1.2.4.3
VERGLEICHENDE
UNTERSUCHUNGEN
DES
ALKALOIDGEHALTS
NACH
INDUKTION
DER
GELBEN
ZELLINIE
MIT
METHYLJASMONAT
BZW.
HEFE
.
119
2.
KLONIERUNG
UND
EXPRESSION
INDUZIERBARER
METHYLTRANSFERASEGENE
AUS
THALICTRUM
TUBEROSUM
.
123
2.1
ISOLIERUNG
VON
METHYLTRANSFERASE-HOMOLOGEN
CDNA
TEILSEQUENZEN
_
124
2.1.1
ENTWURF
METHYLTRANSFERASE-SPEZIFISCHER
PRIMER
.
124
2.1.2
RT-PCR
MIT
ELICITIERTER
RNA
AUS
THALICTRUM
TUBEROSUM
126
2.1.3
SUBKLONIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
DER
PCR-FRAGMENTE
.
128
2.2
UNTERSUCHUNG
DER
ISOLIERTEN
METHYLTRANSFERASE-CDNA
FRAGMENTE
AUF
ELICITIERBARKEIT
.
132
2.2.1
ENTWURF
METHYLTRANSFERASE-SPEZIFISCHER
OLIGONUKLEOTIDSONDEN
.
132
2.2.2
NORTHEM-BLOT
ANALYSEN
VON
RNA
AUS
ELICITIERTEN
SUSPENSIONSKULTUREN
DER
GELBEN
ZELLINIE
VON
THALICTRUM
TUBEROSUM
.
132
2.3
ISOLIERUNG
DER
ELICITIERBAREN
METHYLTRANSFERASE-CDNA-KLONE
.
136
2.3.1
ANLEGEN
UND
DURCHMUSTERN
EINER
X
ZAP
II
CDNA-BIBLIOTHEK
136
2.3.2
IN
VIVO-EXCISION
DER
ISOLIERTEN
CDNA-KLONE
.
136
2.3.3
SEQUENZIERUNG
DER
ISOLIERTEN
CDNA-KLONE
.
138
2.3.4
HOMOLOGIE
UND
DATENBANKVERGLEICHE
DER
ISOLIERTEN
CDNA-KLONE
.
149
2.4
HETEROLOGE
EXPRESSION
DER
METHYLTRANSFERASEGENE
IN
SPODOPTERA
FRUGIPERDA
SF9-INSEKTENZELLEN
.
155
2.4.1
KONSTRUKTION
DES
EXPRESSIONSVEKTORS
.
156
2.4.2
GEWINNUNG
REKOMBINANTER
BACULOVIREN
MIT
DEM
BAC-TO-BAC
BACULOVIRUS
EXPRESSION
SYSTEM
.
158
2.4.3
EXPRESSION
UND
SUBSTRATSPEZIFITAET
DER
HETEROLOG
EXPRIMIERTEN
METHYLTRANSFERASEN
IN
SPODOPTERA
FRUGIPERDA
SF9-INSEKTENZELLEN
159
2.4.4
GENOMISCHE
SOUTHEM-BLOT
ANALYSE
.
169
3.
REINIGUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
HETEROLOG
EXPRIMIERTEN
O-METHYL
TRANSFERASEN
II
THATU
1.1
UND
THATU
2.2
.
172
3.1
REINIGUNG
DER
HETEROLOG
EXPRIMIERTEN
O-METHYLTRANSFERASEN
II
THATU
1.1
UND
THATU
2.2
.
172
3.1.1
GEWINNUNG
DES
ROHEXTRAKTES
UND
FRAKTIONIERTE
AMMONIUMSULFATFAELLUNG
.
172
3.1.2
LONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
AN
DEAE-SEPHACEL
.
173
3.1.3
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
AN
SAH-SEPHAROSE
4B
.
174
3.1.4
ZUSAMMENFASSENDE
UEBERSICHT
UEBER
DIE
REINIGUNG
UND
DARSTELLUNG
INHALTSVERZEICHNIS
IX
DER
HOMOGENITAET
.
176
3.1.5
IDENTIFIKATION
DER
REAKTIONSPRODUKTE
.
181
3.2
CHARAKTERISIERUNG
DER
HOMOGEN
GEREINIGTEN
O-METHYLTRANSFERASEN
II
THATU
1.1
UND
THATU
2.2
183
3.2.1
TEMPERATUROPTIMUM
.
183
3.2.2
PH-OPTIMUM
184
3.2.3
ERMITTLUNG
DES
KW-WERTS
UND
DES
HILLKOEFFIZIENTEN
NH
_
186
3.2.4
COFAKTORABHAENGIGKEIT
.
188
3.2.5
MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG.
190
3.2.6
ISOELEKTRISCHER
PUNKT
.
195
V.
DISKUSSION
197
VI.
ZUSAMMENFASSUNG
.
213
VII.
LITERATURVERZEICHNIS
.
217 |
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| spelling | Frick, Susanne Verfasser aut Klonierung, heterologe Expression, Reinigung und Charakterisierung einer induzierbaren O-Methyltransferase des Benzylisochinolin- und Phenylpropanoidstoffwechsels aus Thalictrum tuberosum L. von Susanne Frick 1999 XIV, 228 S. Ill., graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier München, Univ., Diss., 1998 Thalictrum tuberosum (DE-588)4568194-6 gnd rswk-swf Methyltransferasen (DE-588)4276195-5 gnd rswk-swf Genklonierung (DE-588)4123275-6 gnd rswk-swf Biosynthese (DE-588)4006902-3 gnd rswk-swf Berberin (DE-588)4213712-3 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Thalictrum tuberosum (DE-588)4568194-6 s Berberin (DE-588)4213712-3 s Biosynthese (DE-588)4006902-3 s Methyltransferasen (DE-588)4276195-5 s Genklonierung (DE-588)4123275-6 s DE-604 DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=008544203&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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