Der sensorische Photorezeptor von Chlamydomonas reinhardtii: Sequenzierung, Expression und alternatives Spleißen
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| adam_text | - Z X DER SENSORISCHE PHOTOREZEPTOR VON CHLAMYDOMONAS REINHARDTII
SEQUENZIERANG, EXPRESSION UND ALTERNATIVES SPLEISSEN DISSERTATION ZUR
ERLANGUNG DES DOKTORGRADES DER NATURWISSENSCHAFTEN (DR. RER. NAT.) DER
NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTAET III - BIOLOGIE UND VORKLINISCHE MEDIZIN
- DER UNIVERSITAET REGENSBURG VORGELEGT VON WERNER DEININGER AUS AUGSBURG
1998 INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS I-IV ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
V-VI 1. ZUSAMMENFASSUNG 1-2 2. EINLEITUNG 3-14 2.1. DIE ENTWICKLUNG VON
PHOTOREZEPTOREN 4 2.2. DIE AUGEN DER MIKROORGANISMEN 9 2.3. ALTERNATIVES
SPLEISSEN 11 2.4. AUFGABENSTELLUNG 13 3. ERGEBNISSE 15-52 3.1.
IDENTIFIKATION UND SEQUENZIERUNG DES CHLAMYOPSINGENS (COP) 15 3.2.
PRIMAERSTRUKTUR DES COP-GENPRODUKTES 20 3.3. ALTERNATIVES SPLEISSEN DES
COP-GENS 23 3.4. NACHWEIS BEIDER TRANSKRIPTE IN SYNCHRONISIERTEN ZELLEN
VON C. REINHARDTI 27 3.5. HETEROLOGE EXPRESSION DES CHLAMYOPSINGENS 30
3.5.1. DESIGN DES KASSETTENGENS COPH 30 3.5.2. EXPRESSION IN E. COLI 32
3.5.2.1. DAS EXPRESSIONSSYSTEM 32 3.5.2.2. DURCHFUEHRUNG 32 3.5.3.
EXPRESSION IN S. POMBE 35 3.5.3.1. DAS EXPRESSIONSSYSTEM 35 3.5.3.2.
DURCHFUEHRUNG 35 3.5.4. EXPRESSION DES FO/VOJROPSINGENS VOPH IN S. POMBE
38 3.5.5. EXPRESSION DES ALTERNATIV GESPLEISSTEN
CHLAMYOPSINGENTRANSKRIPTS COMPHL 40 3.5.6. KOEXPRESSION VON COPH UND
COMPL IN 5. POMBE 43 3.5.7. EXPRESSION IN P. PASTORIS 44 3.5.7.1. DAS
EXPRESSIONSSYSTEM 44 3.5.7.2. DURCHFUHRUNG 45 3.5.8. EXPRESSION IN
BHK-ZELLEN 48 3.5.8.1. DAS EXPRESSIONSSYSTEM 48 3.5.8.2. DURCHFUHRUNG 48
3.5.9. EXPRESSION IN C. REINHARDTII 50 3.5.9.1. VERWENDETES
EXPRESSIONSYSTEM 50 3.5.9.2. DURCHFUHRUNG 50 INHALTSVERZEICHNIS 4.
DISKUSSION ; 53-85 4.1. DIE PRIMAERSTRUKTUR DES CBLAMYOPSINS 53 4.2. DIE
PROTEIN-SEKUNDAERSTRUKTUR 59 4.3. EXON-INTRON-STRUKTUR VON OPSINGENEN 63
4.4. G-PROTEIN INTERAKTION ZUR SIGNALVERSTAERKUNG ANALOG ZUM
RINDERRHODOPSIN? 69 4.5. DATENBANKRECHERCHE BRINGT EIN INTERESSANTES
PROTEIN ZUM VORSCHEIN 71 4.6. IST Z93785 DURCH EXONSHUFFLING AUS DEN
ALGENOPSINEN HERVORGEGANGEN? 72 4.7. HETEROLOGE EXPRESSION DES
CHLAMYOPSINS 73 4.7.1. EXPRESSION IN E. COLI 74 4.7.2. EXPRESSION IN
HEFE 76 4.7.3. EXPRESSION IN BHK-ZELLEN 78 4.7.4. HOMOLOGE EXPRESSION IN
C. REINHARDTII 80 4.8. ALTERNATIVES SPLEISSEN 81 5. MATERIAL UND METHODEN
86-109 5.1. KULTURZUCHT 86 5.1.1. ANZUCHT VON CHLAMYDOMONAS REINHARDTII
86 5.1.2. DIFFERENZIERUNG ZU GAMETEN 86 5.1.3. SYNCHRONISATION VON
CHLAMYDOMONAS REINHARDTII CW 806 87 5.1.4. ANZUCHT UND LAGERUNG VON E.
COLI 87 5.1.5. HERSTELLUNG KOMPETENTER E. COLI ZELLEN 87 5.2.
MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 88 5.2.1. ISOLIERUNG UND REINIGUNG VON
NUKLEINSAEUREN 88 5.2.1.1. ISOLIERUNG VON RNA AUS CHLAMYDOMONAS
REINHARDTII 88 5.2.1.2. ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS E. COLI 88
5.2.1.3. ISOLIERUNG VON DNA AUS AGAROSEGELEN 89 5.2.1.4. HERSTELLUNG
SYNTHETISCHER DOPPELSTRANG-DNA 89 5.2.1.5. REINIGUNG VON
OLIGONUKLEOTIDEN 89 5.2.1.6. KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON
OLIGONUKLEOTIDEN 90 5.2.2. NUKLEINSAEURE-GELELEKTROPHORESE 90 5.2.2.1.
AUFTRENNUNG VON DNA 90 5.2.2.2. AUFTRENNUNG VON RNA 90 5.2.2.3.
POLYACRYLAMID-HARNSTOFF-GELELEKTROPHORESE 90 5.2.3. SEQUENZIERUNG VON
DNA 91 5.2.4. SPALTUNG VON DNA DURCH RESTRIKTIONSENZYME 91 II
INHALTSVERZEICHNIS 5.2.5. LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN IN VEKTOR-DNA 91
5.2.5.1. LIGATION VON PCR-PRODUKTEN 91 5.2.5.2. LIGATION VON DNA UEBER
RESTRIKTIONSSCHNITTSTELLEN 92 5.2.6. POLYMERASE KETTENREAKTION 93
5.2.6.1. 3- RACE - PCR 93 5.2.6.2. 5 - RACE - PCR 94 5.2.6.3. RT - PCR
94 5.2.6.4. KOLONIE - PCR 95 5.3. EXPRESSION VON REKOMBINANTEM PROTEIN
95 5.3.1. EXPRESSION UEBER PNEU IN S. POMBE 96 5.3.1.1.
ELEKTROTRANSFORMATION VON 5. POMBE 96 5.3.1.2. TEST DER S.
/ROMFTE-TRANSFORMANTEN 96 5.3.1.3. ANZUCHT VON S. POMFE-TRANSFORMANTEN
FUER PRAEPARATIVE ZWECKE 97 5.3.2. EXPRESSION UEBER PPIC9K IN P. PASTORIS
97 5.3.2.1. ELEKTROTRANSFORMATION VON P.PASTORIS 97 5.3.2.2. TEST DER
P./ A5TOW TRANSFORMANTEN 98 5.3.2.3. ANZUCHT VON P.
POSFORA-TRANSFORMANTEN FUER PRAEPARATIVE ZWECKE 98 5.3.3. EXPRESSION UEBER
PET16B IN E. COLI 99 5.3.3.1. TRANSFORMATION VON E. COLI 99 5.3.3.2.
TEST DER TRANSFORMANTEN 99 5.3.4. EXPRESSION UEBER PSFVI IN BHK-ZELLEN 99
5.3.4.1. DURCHFUEHRUNG 99 5.3.4.2. TEST DER TRANSFORMANTEN 99 5.3.5.
EXPRESSION UEBER PSP 109 IN CHLAMYDOMONAS REINHARDTII 100 5.3.5.1.
TRANSFORMATION VON CHLAMYDOMONAS REINHARDTIICWL5 ARG A 100 5.3.5.2. TEST
DER TRANSFORMANTEN 100 5.4. PROTEINCHEMISCHE METHODEN 101 5.4.1.
REINIGUNG DES CHLAMYOPSINS AUS CHLAMYDOMONAS REINHARDTII CW 806 GAMETEN
101 5.4.2. REINIGUNG DES CHLAMYOPSINS AUS HEFEMEMBRANEN (S. POMBE) 101
5.4.3. REINIGUNG EINES HIS-MARKIERTEN MEMBRANPROTEINS UEBER NI 2+
-NTA-AGAROSE 102 5.4.4. ANALYSE VON PROTEINLOESUNGEN 103 5.4.4.1.
BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION 103 5.4.4.2. PROTEINPRAEZIPITATION
MIT TRICHLORESSIGSAEURE (TCA) 103 III INHALTSVERZEICHNIS 5.4.4.3.
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 103 5.4.4.4. WESTERN
BLOTTING 104 5.4.4.5. FAERBEMETHODEN 104 5.5. MATERIAL 105 5.5.1. STAEMME
105 5.5.2. PLASMIDE 106 5.5.3. BIOCHEMIKALIEN, ENZYME UND MATERIALIEN
106 6. LITERATURVERZEICHNIS 110-124 7. LEBENSLAUF 125 RV
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