Untersuchungen zur Immunglobulin-Klassenwechsel-Rekombination in primären, LPS-stimulierten B-Zellen anhand von extrachromosomalen Substraten:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
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1998
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A.
EINLEITUNG
1
ANTIKOERPER-ISOTYPEN
2
MOLEKULARE
BIOLOGIE
DER
KLASSENWECHSEL-REKOMBINATION
4
B-ZELL-DIFFERENZIERUNG
UND
KLASSENWECHSEL-REKOMBINATION
9
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
10
B.
MATERIAL
UND
METHODEN
11
B.1.
CHEMIKALIEN
11
B.2.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
ZUR
KLONIERUNG
11
B.2.1.
VERWENDETE
BAKTERIENSTAEMME
11
B.2.2.
VERWENDETE
BAKTERIENMEDIEN
11
B.2.3.
VERWENDETE
DNA
12
B.2.4.
HERSTELLUNG
NEUER
RESTRIKTIONSSCHNITTSTELLEN
DURCH
DIE
INSERTION
VON
VERBINDUNGSSTUECKEN
13
B.2.5.
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
UND
-PUFFER
14
B.2.6.
DNA-ENDEN-MODIFIZIERENDE
ENZYME
14
B.2.7.
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSE-GELEN
14
B.2.8.
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
14
B.2.9.
ELEKTROTRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
15
B.2.10.
SCHNELLE
METHODE
ZUR
GEWINNUNG
KLEINER
MENGEN
PLASMID-DNA
15
B.2.1
1.
PRAEPARATION
GROSSER
MENGEN
AN
PLASMID-DNA
15
B.3.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
ZUR
ANALYSE
REEXTRAHIERTER
PLASMID-DNA
16
B.3.1.
SCHNELLE
ALKALISCHE
LYSE
TRANSFIZIERTER
ZELLEN
ZUR
REEXTRAKTION
VON
PLASMID-DNA
AUS
EUKARYOTISCHEN
ZELLEN
16
B.3.2.
RADIOMARKIERUNG
VON
DNA-SONDEN
16
B.3.3.
SOUTHERN
BLOT
ANALYSE
16
B.3.4.
KOLONIEHYBRIDISIERUNG
17
B.4.
ZELLBIOLOGISCHE
METHODEN
18
B.4.1.
ZELLKULTURMEDIUM
19
B.4.2.
MAUSSTAMM
19
B.4.3.
VERWENDETE
ANTIKOERPER
19
B.4.4.
MILZZELLPRAEPARATION
19
B.4.5.
SORTIERUNG
VON
ZELLEN
MITTELS
MACS
19
B.4.6.
LPS-STIMULATION
UND
KULTIVIERUNG
VON
MILZZELLEN
20
B.4.7.
TRANSFEKTION
PRIMAERER
B-ZELLEN
DURCH
ELEKTROPORATION
20
B.4.8.
FICOLL-GRADIENTEN-ZENTRIFUGATION
20
8.4.9.
DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE
ANALYSE
TRANSFIZIERTER
ZELLEN
21
B.4.10.
ZYTOPLASMAFAERBUNG
FIXIERTER
ZELLEN
22
B.5.
KULTIVIERUNG
UND
TRANSFEKTION
DER
PLASMACYTOMA
LINIE
X63
AG8
653
23
C.
KLONIERUNG
DER
SUBSTRATVEKTOREN
24
C.1.
KONSTRUKTION
VON
PSRSORI-SN?SY2B
24
C.2.
KONSTRUKTION
VON
PSRSORI-A.1/SY2B
25
C.3.
KONSTRUKTION
VON
PSRSORI-X1/X2
26
C.4.
KONSTRUKTION
VON
PSRSORI-ASAS
27
C.5.
KONSTRUKTION
VON
PHCD4ORI
28
D.
ERGEBNISSE
29
D.1
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
PRIMAERER
B-ZELLEN
29
D.1.1.
EXPERIMENTELLESTRATEGIE
30
D.1.
1.1
DAS
NACHWEISSYSTEM
30
D.1.1
.2.
UEBERSICHT
UEBER
DEN
VERSUCHSAUFBAU
ZUR
TRANSIENTEN
TRANSFEKTION
PRIMAERER
B-ZELLEN
31
D.
1.1.3.
ZYTOMETRISCHE
ANALYSE
ZUR
BESTIMMUNG
DER
TRANSFEKTIONSEFFIZIENZ
PRIMAERER
B-ZELLEN
32
D.1.1.
3.1.
BESCHRAENKUNG
DER
ZYTOMETRISCHEN
ANALYSE
AUF
B-ZELLEN
32
D.1.
1.3.2.
ZYTOMETRISCHE
BESTIMMUNG
DER
TRANSFEKTIONSEFFIZIENZ
34
D.1
.2.
ETABLIERUNG
DES
STANDARDPROTOKOLLS
ZUR
TRANSFEKTION
PRIMAERER
B-ZELLEN
34
D.1.
2.1.
TRANSFEKTIONSBEDINGUNGEN
35
D.1.
2.2.
VERGLEICHENDE
ZYTOMETRISCHE
ANALYSEN
ZUR
TRANSFEKTION
38
D.1.
2.2.1.
ZYTOMETRISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
TRANSFIZIERTEN
ZELLEN
38
D.1.2.2.2.
TRANSFEKTIONSEFFIZIENZ
UND
B-ZELL-DIFFERENZIERUNG
40
D.1
.3.
EXPRESSIONSKINETIK
UND
CO-TRANSFEKTION
42
D.1.
3.1.
CO-TRANSFEKTION
VON
PHCD4
UND
PH-2K
K
43
D.1.
3.2.
VERLAENGERUNG
DER
HCD4-EXPRESSION
DURCH
REPLIKATION
DES
EXPRESSIONSVEKTORS
44
D.1.
4.
ANREICHERUNG
TRANSFIZIERTER
B-ZELLEN
MITTELS
MACS
48
D.1.
5.
ZUSAMMENFASSUNG
DER
ERGEBNISSE
ZUR
TRANSIENTENTRANSFEKTION
PRIMAERER
B-ZELLEN
50
D.2.
ANALYSEN
ZUR
KLASSENWECHSEL-REKOMBINATION
IN
LPS-STIMULIERTEN
PRIMAEREN
B-ZELLEN
53
D.2.1
.
ENTWICKLUNG
EINES
IN
VITRO-SYSTEMS
ZUR
ANALYSE
VON
KLASSENWECHSEL-AKTIVITAET
IN
PRIMAEREN
B-ZELLEN
53
D.2.1.
1.
UEBERSICHTUEBERDENVERSUCHSAUFBAU
53
D.2.1.
2.
DAS
KLASSENWECHSEL-REKOMBINATIONS-SUBSTRAT:
PSRSORI-SP/S72B
54
D.2.1.
3.
NACHWEIS
VON
KLASSENWECHSEL-AKTIVITAET
57
D.2.2.
ANALYSEN
ZUR
KINETIK
DER
KLASSENWECHSEL-AKTIVITAET
59
D.2.3.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
ANALYSEN
ZUR
REKOMBINATION
VON
PSRSORI-SN/SY2B
62
D.2.3.1.
ANALYSE
DER
REEXTRAHIERTEN
DNA
DURCH
SOUTHERN-BLOTS
63
D.2.3.2.
ANALYSE
DER
REEXTRAHIERTEN
DNA
DURCH
KOLONIEHYBRIDISIERUNG
65
D.2.4.
ANALYSEN
ZUR
KLASSENWECHSEL-REKOMBINATION
ANHAND
VON
SUBSTRATMODIFIKATIONEN
67
D.2.4.
1.
ABHAENGIGKEIT
DER
KLASSENWECHSEL-REKOMBINATION
VON
S-REGIONEN
68
D.2.4.2.
ABHAENGIGKEIT
DER
KLASSENWECHSEL-REKOMBINATION
VON
DER
PROZESSIERUNG
DER
SUBSTRAT-TRANSKRIPTE
70
D.2.5.
ANALYSE
DER
SUBSTRAT-REKOMBINATION
IN
"
NICHT-REKOMBINIERENDEN
"
ZELLEN
72
D.2.6.
ZUSAMMENFASSENDE
DARSTELLUNG
DER
ERGEBNISSE
ZUR
SUBSTRAT-REKOMBINATION
75
E.
DISKUSSION
76
E.1.
DAS
NACHWEISSYSTEM
76
E.2.
DIE
ANALYSE
DER
KLASSENWECHSEL-REKOMBINATION
ANHAND
VON
EXTRACHROMOSOMALEN
SUBSTRATEN
78
E.3.
DIE
KINETIK
DER
KLASSENWECHSEL-AKTIVITAET
IN
LPS-STIMULIERTEN
PRIMAEREN
B-ZELLEN
80
E.4.
DIE
BEDEUTUNG
DER
PROZESSIERUNG
DER
TRANSKRIPTE
FUER
DIE
KLASSENWECHSEL-REKOMBINATION
84
E.5.
DIE
SWITCH-REGION-SPEZIFITAET
DER
KLASSENWECHSEL-AKTIVITAET
86
E.6.
DIE
REKOMBINATION
DER
SUBSTRATE
IN
"
NICHT-REKOMBINIERENDEN
"
ZELLEN
88
F.
ZUSAMMENFASSUNG
90
G.
LITERATURVERZEICHNIS
91
ANMERKUNG
LEBENSLAUF
ERKLAERUNG
UND
PUBLIKATIONSLISTE |
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