Untersuchung von Zellfabriken für bioaktive Peptide aus Bacillus brevis und Bacillus subtilis:
Gespeichert in:
1. Verfasser: | |
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Format: | Abschlussarbeit Buch |
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1999
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I
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
I
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
VII
1.
EINLEITUNG
1
1.1
ZELLFABRIKEN
FUER
DIE
PRODUKTION
VON
BIOLOGISCH
AKTIVEN
PEPTIDEN
AUS
BACILLUS
BREVIS
UND
BACILLUS
SUBTILIS
.
1
1.2
DIE
FAMILIE
DER
BACILLACEAE
.
3
1.3
DAS
MULTIPLE
CARRIER
MODELL
DER
NICHT-RIBOSOMALE
PEPTID-BIOSYNTHESE
.
4
1.4
MODULARE
STRUKTUR
VON
PEPTIDSYNTHETASEN.
.
6
1.5
BELADUNGSZUSTANDE
DES
4
'-PHOSPHOPANTETHEIN-KOFAKTORS
.
9
1.6
DIE
FAMILIE DER
PHOSPHOPANTETHEINYL-TRANSFERASEN
.
9
1.7
THIOESTERASEFUNKTIONEN
VON
PEPTIDSYNTHETASEN
.
10
1.8
INITIATION
DER
LIPOPEPTID-BIOSYNTHESE
.
13
1.9
GEZIELTES
DESIGN
NEUER
PEPTID
UND
LIPOPEPTIDWIRKSTOFFE
.
13
2.
ZIELSETZUNG
16
3.
MATERIAL
UND
METHODEN
18
3.1
MATERIAL
.
18
3.2
METHODEN
.
22
3.2.1
ZELLANZUCHT
.
22
3.2.1.1
FERMENTATION
VON
BACILLUS
BREVIS
.
23
3.2.1.2
ANZUCHT
VON
BACILLUS
SUBTILIS-STAEMMEN
.
23
3.2.1.3
ANZUCHT
VON
ESCHERICHIA
COLI
ML
5
UND
DH5A
.
23
3.2.1.4
STAMMHALTUNG
.
24
3.2.2
GENETISCHE
METHODEN
.
24
3.2.2.1
DNA
MANIPULATIONEN
.
24
3.2.2.2
HERSTELLEN
KOMPETENTER
ZELLEN
MIT
RBCH
.
24
3.2.2.3
PRAEPARATION
CHROMOSOMALER
DNA
AUS
BACILLUS
BREVIS
.
25
II
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.2.4
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
AUS
ESCHERICHIA
COLI
.
25
3.2.2.5
POLYMERASE
KETTENREAKTION
(PCR)
.
26
3.2.3
PRAEPARATION
VON
LIPOPEPTIDEN
.
26
3.2.4
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
.
27
3.2.4.1
PRAEPARATION
DER
GRAMICIDIN
S
SYNTHETASE
TEILENZYME
1
UND
2
.
27
3.2.4.1.1
PUFFER
UND
LOESUNGEN
FUER
ZELLAUFSCHLUSS
UND
ENZYMPRAEPARATION
.
27
3.2.4.1.2
SCHEMA
ZUR
PRAEPARATION
DER
GRAMICIDIN
S
SYNTHETASE
TEILENZYME
1
UND
2
.
28
3.2.4.1.3
HERSTELLUNG
EINES
ZELLFREIEN
ROHEXTRAKTES
.
29
3.2.4.1.4
GELPERMEATIONSCHROMATOGRAPHIE
AN
ULTROGEL
ACA
34
.
29
3.2.4.1.5
ANIONENAUSTAUSCH-FPLC
AN
TSK-DEAE
150/10
.
29
3.2.4.1.6
HOCHAUFLOESENDE
ANIONENAUSTAUSCH-FPLC
AN
MONO
Q
HR
5/5
UND
TSK-TMAE
HR
150/10
.
29
3.2.4.1.7
SACCHAROSE
DICHTEGRADIENTEN-ZENTRIFIIGATION
.
30
3.2.4.2
PRAEPARATION
VON
GRST
.
30
3.2.4.2.1
GELELEKTROPHORESECHROMATOGRAPHIE
VON
GRST
.
30
3.2.4.2.2
REINIGUNG
VON
MBP-GRST-FUSIONSPROTEIN
.
31
3.2.4.2.3
REINIGUNG
VON
GRST
MIT
6
HISTIDIN-RESTEN
AM
N-TERMINUS
.
31
3.2.4.3
BESTIMMUNG
ENZYMATISCHER
AKTIVITAETEN
.
32
3.2.4.3.1
ADENYLIERUNG
DER
SUBSTRATAMINOSAEUREN
DURCH
DIE
GRAMICIDIN
S
SYNTHETASE
.
32
3.2.4.3.2
THIOESTERBELADUNG
MIT
SUBSTRATAMINOSAEUREN
.
32
3.2.4.3.3
BIOSYNTHESE
VON
GRAMICIDIN
S
.
33
3.2.4.3.4
BESTIMMUNG
DER
THIOESTERHYDROLYSE-AKTIVITAET
VON
GRST
.
33
3.2.4.4
PROTEINBESTIMMUNG
.
34
3.2.4.5
ELEKTROPHORETISCHE
METHODEN
.
34
3.2.4.5.1
PUFFER
FUER
DIE
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
.
34
3.2.4.5.2
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
.
34
III
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.4.5.3
GELELEKTROPHORESECHROMATOGRAPHIE
.
35
3.2.4.5.4
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
35
3.2.4.5.5
WESTEM-BLOTTING
.
36
3.2.4.6
IMMUNOLOGISCHE
ARBEITEN
UND
VERFAHREN
.
37
3.2.4.6.1
REINIGUNG
VON
ANTIKOERPERN
GEGEN
GRST
AUS
KANINCHEN
ANTISEREN
.
37
3.2.4.6.2
PUFFER
UND
LOESUNGEN
FTLR
IMMUNCHEMISCHE
NACHWEISE
VON
GRST
.
37
3.2.4.6.3
IMMUNCHEMISCHER
NACHWEIS
VON
GRST
AUF
MEMBRANEN
.
38
3.2.4.6.4
IMMUNCHEMISCHER
NACHWEIS
VON
GRST
IN
MIKROTITERPLATTEN
.
38
3.2.4.7
SPEZIFISCHE
MARKIERUNG
DER
BINDUNGSSTELLE
VON
GS2
FUER
DAS
TRIPEPTID
INTERMEDIAT
D-PHENYLALANYL-L-PROLYL-L-VALIN
.
39
3.2.4.8
PROTEIN
UND
PEPTIDFRAGMENTIERUNGSVERFAHREN
.
39
3.2.4.8.1
CHEMISCHE
SPALTUNG
VON
GS2
MIT
BROMCYAN
.
39
3.2.4.8.2
ENZYMATISCHER
VERDAU
VON
GS2
MIT
STAPHYLOCOCCUS
AUREUS
V8
ENDOPROTEINASE
GLUC
.
39
3.2.4.83
ENZYMATISCHER
VERDAU
VON
GRST
MIT
TRYPSIN
IM
GEL
.
40
3.2.4.9
REVERSED
PHASE-HPLC
.
40
3.2.4.9.1
REINIGUNG
DES
MIT
DEM
TRIPEPTIDE
TRIPEPTID
D-PHE-L-PRO-L-VAL
MARKIERTEN
REAKTIONSZENTRUMPEPTIDS
VON
GS2
.
41
3.2.4.9.2
REINIGUNG
TRYPTISCHER
FRAGMENTE
VON
GRST
.
41
3.2.4.93
CHARAKTERISIERUNG
DES
LIPOPEPTIDSPEKTRUMS
VON
B.
SUBTILIS
AL/3
MITTELS
HPLC
AN
HYPERSIL-ODS
.
41
3.2.4.9.4
SMART-HPLC
VON
AMINOSAEURE-COA-DERIVATEN
.
42
3.2.4.10
ANALYTISCHE
VERFAHREN
ZUR
CHARAKTERISIERUNG
VON
PEPTIDEN
UND
LIPOPEPTIDEN
.
42
3.2.4.10.1
DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE
.
42
3.2.4.10.2
AMINOSAEURESEQUENZANALYSE
.
42
3.2.4.10.3
AMINOSAEUREANALYSE
.
43
IV
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.4.11
MASSENSPEKTROMETRISCHE
UNTERSUCHUNGEN
.
44
3.2.4.11.1
ANALYSE
VON
PEPTIDEN
UND
LIPOPEPTIDEN
.
44
3.2.4.11.2
ANALYSE
VON
GANZEN
ZELLEN
.
44
4.
ERGEBNISSE
45
4.1
UNTERSUCHUNG
DER
NICHT-RIBOSOMALEN
PEPTID-BIOSYNTHESE
AUF
MOLEKULARER
EBENE.
45
4.1.1
CHARAKTERISIERUNG
VON
GRST
.
46
4.1.1.1
NACHWEIS
VON
GRST
IM
ROHEXTRAKT
VON
BACILLUS
BREVIS
ATCC
9999
.
46
4.1.1.2
NACHWEIS
VON
GRST
IN
PRAEPARATIONEN
VON
GS
1
UND
GS2
.
52
4.1.1.3
UEBEREXPRESSION
VON
GRST
.
53
4.1.1.3.1
UEBEREXPRESSION
ALS
MBP-GRST-FUSIONSPROTEIN
.
53
4.1.1.3.2
UEBEREXPRESSION
VON
GRST
MIT
6
HISTIDIN-RESTEN
AM
N-TERMINUS
.
56
4.1.1.4
FUNKTIONSSTUDIEN
AN
GRST
.
58
4.1.1.4.1
HYDROLYSE
VON
THIOESTERN
DURCH
GRST
.
58
4.1.1.4.2
EINFLUSS
VON
GRST
AUF
DIE
SPEZIFISCHE
GRAMICIDIN
S
BIOSYNTHESE-AKTIVITAET
.
59
4.1.1.4.3
EINFLUSS
VON
GRST
AUF
DIE
PRODUKTBILDUNG
.
60
4.1.1.4.4
EINFLUSS
VON
PMSF
AUF
DIE
BIOSYNTHESE
VON
GRAMICIDIN
S
.
63
4.1.2
VERIFIZIERUNG
DES
MULTIPLE
CARRIER
MODELLS
.
63
4.1.2.1
ISOLIERUNG
UND
STRUKTURAUFKLAERUNG
DER
BINDUNGSSTELLE
DES
TRIPEPTIDS
D-PHE-L-PRO-L-VAL
IN
DER
GRAMICIDIN
S
BIOSYNTHESE
.
63
4.1.2.1.1
UNTERSUCHUNG
DER
TRIPEPTID-BILDUNG
MITTELS
DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE
.
64
4.1.2.1.2
REINDARSTELLUNG
DES
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
PHE-PRO-VAL-GS2-PEPTIDFRAGMENTS
.
66
4.1.2.1.3
STRUKTURAUFKLAERUNG
DES
PHE-PRO-VAL-MARKIERTEN
PEPTIDFRAGMENTS
AUS
GS2
.
;
.
68
4.1.2.1.3.1
SEQUENZANALYSE
.
68
4.1.2.1.3.2
MALDI-MS-ANALYSE
.
68
4.1.2.1.3.3
AMINOSAEUREANALYSE
.
70
INHALTSVERZEICHNIS
4.1.2.2
UEBERTRAGUNG
VON
PHENYLALANIN
AUF
THIOLREAGENZIEN
DURCH
GS1
.
72
4.1.2.2.1
DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE
VON
[
L4
C]PHE
MARKIERTEN
THIOLREAGENZIEN.
73
4.1.2.2.2
SMART-HPLC
VON
[
L4
C]PHE-COA
AN
EINER
PRPC
SC
2.1/10-SAEULE
.
74
4.2
MASSENSPEKTROMETRISCHE
CHARAKTERISIERUNG
BIOAKTIVER
PEPTIDE
AUS
B.
BREVIS
UND
B.
SUBTILIS
.
76
4.2.1
GEZIELTE
SUBSTITUTION
VON
AMINOSAEUREN
IN
GRAMICIDIN
S
.
76
4.2.1.1
UNTERSUCHUNG
VON
GRAMICIDIN
S
VARIANTEN
MITTELS
MALDI-MS
.
76
4.2.1.2
STRUKTURAUFKLAERUNG
VON
GRAMICIDIN
S
DURCH
MALDI-MS
ANALYSE
AN
GANZEN
B.
BREVIS
ATCC
9999
ZELLEN
.
78
4.2.2
MALDI-MS
UNTERSUCHUNGEN
AN
GANZEN
BACILLUS
SUIRI/TS-ZELLEN
.
83
4.2.2.1
TYPISIERUNG
VON
BACILLUS
SU6TI7IS-STAEMMEN
MITTELS
MALDI-MS
.
84
4.2.2.2
IDENTIFIZIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
SEKUNDAER-METABOLITEN.
87
4.2.2.3
LOKALISIERUNG
VON
METABOLITEN
IN
KOMPARTIMENTEN
DER
BACILLUS
SUBTILIS-ZEUEE
.
90
4.2.3
CHARAKTERISIERUNG
DER
LIPOPEPTID-PRODUKTE
AUS
BACILLUS
SUBTILIS
AL/3
UND
DER
MUTANTE
7A
.
93
4.2.3.1
VERGLEICH
DES
LIPOPEPTID-SPEKTRUMS
VON
B.
SUBTILIS
AL/3
UND
DER
MUTANTE
7A
MITTELS
MALDI-MS
.
94
4.2.3.2
DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHISCHE
PRODUKTANALYSE
IM
METHANOLISCHEN
EXTRAKT
.
95
4.2.3.3
REINIGUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
VON
B.
SUBTILIS
AL/3
UND
DER
MUTANTE
7A
GEBILDETEN
LIPOPETIDE
.
96
5.
DISKUSSION
102
S.L
MOLEKULARE
MECHANISMEN
DER
NICHT-RIBOSOMALEN
PEPTID-BIOSYNTHESE
.
102
5.1.1
CHARAKTERISIERUNG
DER
BINDUNGSSTELLE
FUER
DAS
TRIPEPTID-INTERMEDIAT
D-PHENYLALANYL-L-PROLYL-L-VALIN
IN
DER
GRAMICIDIN
S
BIOSYNTHESE
.
102
5.1.2
UEBERTRAGUNG
VON
PHENYLALANIN
AUF
THIOLREAGENZIEN
DURCH
DIE
GRAMICIDIN
S
SYNTHETASE
1
.
103
5.1.3
EINFLUSS
VON
GRST
AUF
DIE
BIOSYNTHESE
VON
GRAMICIDIN
S
.
105
5.1.4
FUNKTION
VON
THIOESTERASEN
IN
DER
PEPTID
UND
POLYKETID-BIOSYNTHESE
.
107
VI
INHALTSVERZEICHNIS
5.2
ENTWICKLUNG
MASSENSPEKTROMETRISCHER
METHODEN
FUER
DIE
DETEKTION
UND
STRUKTURAUFKLAERUNG
VON
PEPTID-WIRKSTOFFEN
.
117
5.2.1
UNTERSUCHUNG
VON
GRAMICIDIN
S-VARIANTEN
MITTELS
MALDI-MS
.
117
5.2.2
UNTERSUCHUNG
VON
GANZEN
BACILLUS-ZELLEN
MITTELS
MALDI-MS
.
118
5.2.3
STRUKTURAUFKLAERUNG
ZYKLISCHER
PEPTIDE
MITTELS
MALDI-MS
.
120
6.
LITERATURVERZEICHNIS
123 |
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