Nikotinische Acetylcholinrezeptoren des Nervensystems von Drosophila melanogaster: funktionelle Charakterisierung von Acetylcholin-bindenden Untereinheiten
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INHALT
I.
EINLEITUNG
1
1.
1.
NIKOTINISCHE
ACETYLCHOLINREZEPTOREN
IN
VERTEBRATEN
2
1.
1.1.
MUSKELREZEPTOREN
3
1.
1.
2.
NEURONALE
NIKOTINISCHE
ACETYLCHOLINREZEPTOREN
IN
VERTEBRATEN
4
1.
2.
NIKOTINISCHE
ACETYLCHOLINREZEPTOREN
IN
INSEKTEN
6
1.
3.
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
9
II.
MATERIAL
11
II.
1.
FEINCHEMIKALIEN
11
II.
2.
VERBRAUCHSMATERIAL
11
II.
3.
ALLGEMEINE
LOESUNGEN
UND
MATERIALIEN
11
II.
4.
KITS
UND
ENZYME
FUER
DIE
MOLEKULARBIOLOGIE
12
II.
5.
VEKTOREN
12
II.
6.
CDNA-KONSTRUKTE
13
II.
7.
GENOMISCHE
PHAGEN
DER
REGION
7E
13
II.
8.
OLIGONUKLEOTIDE
13
II.
9.
BAKTERIENSTAMM
13
II.
10.
ANTIKOERPER
14
II.
11.
FLIEGENSTAEMME
14
III.
METHODEN
15
III.
1.
MOLEKULARBIOLOGIE
15
III.
1.1.
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
15
HI.
1.
2.
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
15
DI.
1.
3.
RESTRIKTION
VON
DNA
16
HI.
1.4.
GELEKTROPHORETISCHES
AUFTRENNEN
VON
DNA-MOLEKUELEN
16
M.
1.5.
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
16
M.
1.6.
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
16
IH.
1.
7.
KLONIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
17
HI.
1.8.
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
17
UI.
1.
9.
ANALYSE
VON
SEQUENZDATEN
MIT
DEM
PROGRAMMPAKET
GCG
17
M.
1.10.
HERSTELLEN
VON
EXPRESSIONSKONSTRUKTEN
17
HL
1.10.1.
ALS-DELETIONSKONSTRUKTE
17
HI.
1.10.2.
PMT3-KONSTRUKTE
ZUR
HETEROLOGEN
EXPRESSION
18
FFL.
1.10.
3.
ALS-DELETIONSKONSTRUKTE
ZUR
KEIMBAHNTRANSFORMATION
VON
FLIEGEN
21
HI.
1.10.4.
KONSTRUKTE
ZUR
EXPRESSION
VON
FUSIONSPROTEINEN
IN
BAKTERIEN
21
IH.
1.11.
PRAEPARATION
GENOMISCHER
DNA
AUS
FLIEGEN
21
III.
1.12.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA:
RANDOM
PRIMING
HI.
1.13.
SOUTHERN-BLOT
UND
FILTERHYBRIDISIERUNG
III.
1.14.
RNA-PRAEPARATION
IN.
1.15.
NORTHEM-BLOT
UND
-HYBRIDISIERUNG
III.
2.
BIOCHEMIE
UI.
2.1.
AUF
REINIGUNG
VON
FUSIONSPROTEINEN
M.
2.2.
IMMUNISIERUNG
VON
KANINCHEN
UI.
2.
3.
REINIGUNG
VON
DA3-ANTIKOERPEM
HI.
2.
4.
HERSTELLEN
MONOSPEZIFISCHER
SEREN
HI.
2.5.
TEST
DER
DA3-ANTISEREN
AUF
SPEZIFITAET
IH.
2.6.
PROTEINBESTIMMUNG
M.
2.
7.
SDS-POLYACRYLAMIDGELELETROPHORESE,
WESTERN-BLOT
UND
IMMUNDETEKTION
III.
3.
ELEKTROPHYSIOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGEN
HI.
3.1.
INJEKTION
VON
CDNA-KONSTRUKTEN
IN
XENOPUS-OOZYTEN
IN.
3.1.1.
VORBEREITUNG
DER
XENOPUS-OOZYTEN
IH.
3.1.2.
INJEKTION
M.
3.1.
3.
EXPRESSIONSKONSTRUKTE
IH.
3.
2.
ELEKTROPHYSIOLOGISCHE
ABLEITUNGEN
IH.
3.3.
LOESUNGEN
UND
TOXIN-APPLIKATION
HI.
3.4.
DATEN-ANALYSE
III.
4.
FLIEGENZUCHT
UND
-GENETIK
IH.
4.1.
FLIEGENHALTUNG
IH.
4.
2.
GAL4-UAS-SYSTEM
IN
FLIEGEN
(BRAND
&
PERRIMON,
1993)
M.
4.3.
KEIMBAHN-TRANSFORMATION
VON
FLIEGEN
IH.
4.4.
TRANSGENE
PROTEINEXPRESSION
III.
5.
IMMUNHISTOCHEMIE
IN.
5.1.
WHOLE
MOUNT
EMBRYONEN
HI.
5.
2.
IMAGINALSCHEIBEN
AUS
L3-LARVEN
HI.
5.
3.
GEFRIERSCHNITTE
ADULTER
KOEPFE
IV.
ERGEBNISSE
IV.
1.
HETEROLOGE
EXPRESSION
VON
DROSOPHILA
NACHR-A-UNTEREINHEITEN
IV.
1.1.
THEORETISCHE
UEBERLEGUNGEN
ZUM
ASSEMBLY
VON
NACHR-UNTEREINHEITEN
IV.
1.
2.
ACH-SENSITITIVITAET
NACH
KO-INJEKTION
VON
ALS-,
DA2-,
UND
SS2-CDNA
IV.
1.3.
A-BGT-EFFEKTE
IV.
1.3.1
A-BGT-EFFEKTE
AUF
ALS/SS2
BZW.
DA2/SS2-REZEPTOREN
IV.
1.3.
2.
A-BGT-EFFEKTE
AUF
POTENTIELLE
ALS/DA2/SS2-REZEPTOREN
37
TV.
1.4.
EFFEKT
DER
ALSA-UNTEREINHEIT
AUF
DIE
EXPRESSION
FUNKTIONELLER
NACHREN
40
S
S
I
S
A
S
A
OE
A
A
A
S
OE
OE
S
G
G
K
K
K
K
K
OE
B
B
B
B
B
II
IV.
2.
TRANSGENE
EXPRESSION
EINER
DELETIERTEN
ALS-UNTEREINHEIT
IN
VIVO
43
IV.
2.1.
HERSTELLUNG
TRANSGENER
FLIEGEN
43
IV.
2.1.1.
ERGEBNIS
DER
FLIEGENTRANSFORMATION
43
IV.
2.1.
2.
NACHWEIS
DER
INSERTION
-
SOUTHEM-BLOT-ANALYSE
44
IV.
2.
2.
TRANSGENE
ALSA-EXPRESSION
45
IV.
2.
2.1.
NACHWEIS
DER
TRANSGEN
EXPRIMIERTEN
ALS-TRANSKRIPTE
45
IV.
2.2.
2.
NACHWEIS
DER
TRANSGEN
EXPRIMIERTEN
ALSA-UNTEREINHEITEN
45
IV.
2.
2.3.
EXPRESSION
VON
DELETIERTEM
ALS-PROTEIN
IN
TRANSGENEN
FLIEGEN
46
IV.
3.
CHARAKTERISIERUNG
DER
NACHR-A-UNTEREINHEIT
DA3
48
IV.
3.1.
DA3-GENSTRUKTUR
UND
CDNA-SEQUENZ
48
IV.
3.
2.
VERGLEICH
DER
DA3-SEQUENZ
MIT
ANDEREN
NACHR-UNTEREINHEITEN
53
IV.
3.3.
EXPRESSION
DA3-ENTHALTENDER
REZEPTOREN
IN
XENOPUS-OOZYTEN
56
IV.
3.4.
EXPRESSION
DES
DOS-GENS
59
V.
DISKUSSION
64
V.
1.
CHARAKTERISIERUNG
DES
ALS/DA2/SS2-REZEPTORS
64
V.
2.
EXPRESSION
DELETIERTER
ALS-UNTEREINHEITEN
IN
VIVO
67
V.
3.
CHARAKTERISIERUNG
DER
DROSOP/N'IA-NACHR-UNTEREINHEIT
DA3
69
VI.
ZUSAMMENFASSUNG
72
VII.
ABKUERZUNGEN
73
VIII.
LITERATUR
76
IX.
ANHANG
85
III |
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