Entwicklung eines Immunfluoreszenz-Focus-Assays (IFKA) zur Prüfung der In-vitro-Empfindlichkeit klinischer HIV-1-Isolate gegenüber Chemotherapeutika:
Gespeichert in:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1998
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| Beschreibung: | XVI, 125 S. Ill., graph. Darst. |
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
1
2
MATERIAL
UND
METHODEN
3
2.1
SUBSTANZEN,
MEDIEN
.
3
2.2
ZELLEN
.
3
2.2.1
MT4-ZELLEN
.
3
2.2.2
HELA-CD4-ZELLEN
.
4
2.2.3
PBL
(PERIPHERE
BLUTLEUKOZYTEN)
.
.4
2.2.4
NBL
(NABELSCHNURBLUT-LEUKOZYTEN)
.
6
2.3
VIRUS
.
7
2.3.1
PATIENTEN-ISOLATE
.
7
2.3.2
BEZEICHNUNG
DER
PATIENTEN-ISOLATE
.
8
2.3.3
VIRUSANZUCHT
(GEWINNUNG
DER
HIV-ISOLATE)
.
8
2.3.3.1
HIV-PRIMAERKULTUR
.
9
2.3.3.2
HIV-SEKUNDAERKULTUR
.
9
2.4
TITRATIONEN
.
11
2.4.1
HELA-CD4-IMMUNFUORESZENZ-FOCUS-ASSAY
(IFFA)
.
11
2.4.1.1
ZELLAUSSAAT
.
11
2.4.1.2
VERDUENNUNG
DER
HIV-KULTURUEBERSTAENDE
.
12
2.4.1.3
INFEKTION
UND
INKUBATION
.
12
2.4.1.4
UEBERFUEHREN
DER
ZELLEN
AUF
OBJEKTTRAEGER
UND
FIXIERUNG
DER
ZELLEN
.
13
2.4.1.5
ANTIKOERPERAPPLIKATION
.
14
2.4.1.6
AUSWERTUNG
.
14
2.4.1.7
BERECHNUNG
DER
VIRUS-TITER
.
18
2.4.2
HELA-CD4-PLAQUE-ASSAY
.
18
2.4.3
MT4-PLAQUE-ASSAY
.
21
2.4.3.1
ZELLAUSSAAT
.
21
2.4.3.2
VERDUENNUNG
DER
VIRUSUEBERSTAENDE
.
22
2.4.3.3
INFEKTION
UND
INKUBATION.
.
22
2.4.3.4
FAERBUNG
UND
AUSWERTUNG
.
23
2.4.3.5
BERECHNUNG
DER
VITUSTITER
.
.23
2.4.4
MT4-COLORIMETRISCHER
ASSAY
.
24
2.4.4.1
ZELLAUSSAAT
.
24
2.4.4.2
VIRUS-VERDUENNUNG
UND
INKUBATION
.
24
2.4.4.3
FAERBUNG,
FIXIERUNG
UND
AUSWERTUNG
.
25
2.4.5
PBL-COLORIMETRISCHER
ASSAY
.
26
2.5
SENSITIVITAETSTESTS
.
26
2.5.1
SENSITIVITAETSTESTS
MIT
DEM
HELA-CD4-IFFA
.
26
2.5.1.1
ZELLAUSSAAT
.
26
5.2.1.2
VERDUENNUNG
DER
SUBSTANZEN
(AZT
BZW.
DDL)
.
26
2.5.1.3
VERDUENNUNG
DER
VIRUSUEBERSTAENDE
.
27
2.5.1.4
INKUBATION
VON
SUBSTANZ
UND
VIRUS
.
27
2.5.1.5
UEBERFUEHREN
DER
ZELLEN
AUF
OBJEKTTRAEGER,
FIXIERUNG,
ANTIKOERPERAPPLIKATION
UND
AUSWERTUNG
.
28
2.5.1.6
BERECHNUNG
DER
ID50.
29
2.5.2
SENSITIVITAETSTESTS
MIT
DEM
MT4-PLAQUE-ASSAY
.
30
2.5.2.1
ZELLAUSSAAT
.
30
2.5.2.2
VERDUENNUNG
VON
AZT
.
30
2.5.2.3
VERDUENNUNG
DER
VIRUSUEBERSTAENDE
.
30
2.5.2.4
INKUBATION
VON
AZT
UND
VIRUS
.
30
2.5.2.5
FAERBUNG
UND
AUSWERTUNG
.
31
2.5.2.6
BERECHNUNG
DER
ID50
.
31
2.5.3
SENSITIVITAETSTESTS
MIT
DEM
MT4-COLORIMETRISCHEN
ASSAY
.
31
2.5.3.1
AZT-VERDUENNUNG
.
31
2.5.3.2
INFEKTION,
ZELLAUSSAAT
UND
INKUBATION
.
32
2.5.3.3
FAERBUNG,
FIXIERUNG
UND
AUSWERTUNG
.
33
2.5.4
SENSITIVITAETSTESTS
MIT
DEM
PBL-COLORIMETRISCHEN
ASSAY
.
33
2.6
QUANTIFIZIERUNG
HIV-INFIZIERTER
PBL
UND
MT4-ZELLEN
MIT
DEM
FLUORESZENZZYTOMETER
(FACS)
.
33
2.6.1
INFEKTION,
ZELLAUSSAAT
UND
INKUBATION
.
33
2.6.2
FIXIERUNG
DER
ZELLEN
.
34
2.6.3
ANTIKOERPERAPPLIKATION
.
34
2.6.4
MESSUNG
UND
AUSWERTUNG
.
35
XN
3
ERGEBNISSE
36
3.1
OPTIMIERUNG
DER
VIRUSKULTIVIERUNG
.
36
3.1.1
AUSTESTUNG
VON
INTERLEUKIN-2
(IL-2)
.
36
3.1.2
AUSTESTUNG
VON
PHYTOHEMAGGLUTININ
(PHA)
.
39
3.1.3
SPENDERPLASMA
ALS
RINDERSERUM-(FCS-)
ERSATZ
.
40
3.2
TITRATIONEN
.
.41
3.2.1
HELA-CD4-IFFA
UND
HELA-CD4-PLAQUE-ASSAY
.
41
3.2.1.1
EINFLUSS
VON
POLYBREN
AUF
DEN
HIV-TITER
.
.41
3.2.1.2
EINFLUSS
VON
DEAE-DEXTRAN
AUF
DEN
HIV-TITER
.
43
3.2.1.2.1
EINFLUSS
DER
INKUBATIONSDAUER
BEI
VERWENDUNG
VON
DEAE-DEXTRAN
.
.43
3.2.1.2.2
EINFUSS
DER
DEAE-DEXTRAN
KONZENTRATION
(IFFA)
.
46
3.2.1.3
EINFLUSS
DER
VIRUSADSORPTIONZEIT
AUF
DEN
HIV-TITER
(IFFA)
.
46
3.2.1.4
EINFUSS
DER
ABLESEZEIT
AUF
DEN
HIV-TITER
(IFFA)
.
47
3.2.1.5
ZUSAMMENFASSUNG
DER
STANDARD
METHODIK
IM
HELA
SYSTEM
.
48
3.2.1.6
EINFLUSS
DER
KULTIVIERUNGSDAUER
BEI
DER
VIRUSSTOCK
PRAEPARATION
AUF
VIRUSTITER
(IFFA)
UND
CPE
.
.48
3.2.1.7
VIRUSTITER
VON
HIV-PRIMAER
UND
SEKUNDAERKULTUREN
IM
HELA-CD4-IFFA
UND
BEZUG
ZUM
CPE
.
50
3.2.1.8
ANTEIL
DER
IM
HELA-CD4-IFFA
TITRIERBAREN
ISOLATE
AN
DEN
CPE-POSITIVEN
ISOLATEN
.
51
3.2.2
TITER
FRISCHER
UND
TIEFGEFORENER
HIV-KULTURUEBERSTAENDE
IM
MT4-PLAQUE-ASSAY
.
51
3.2.2.1
TITER
VON
SEKUNDAERKULTUREN
IM
MT4-PA
UND
HELA-CD4-IFFA
.
52
3.2.2.2
TITER
VON
HIV-PRIMAERKULTUREN
IM
MT4-PA
UND
HELA-CD4-IFFA,
BEZUG
ZUM
CPE
.
53
3.2.2.3
ANTEIL
DER
IM
MT4-PA
TITRIERBAREN
ISOLATE
AN
DEN
CPE-POSITIVEN
ISOLATEN
.
55
3.2.3
COLORIMETRISCHE
ASSAYS
(CA)
.
55
3.2.3.1
VORBEREITENDE
ARBEITEN
.
55
3.2.3.1.1
ABSORPTIONSFILTER
.
55
3.2.3.1.2
BESTIMMUNG
DER
BESTEN
ZEITZAHL
.
56
3.2.3.2
TITRATIONEN
MIT
DEM
MT4-CA
.
59
3.2.3.3
TITRATIONEN
MIT
DEM
PBL-CA
.
61
XM
3.3
SENSITIVITAETSTESTS
.
62
3.3.1
AZT-SENSITIVITAETSTESTS
MIT
DEM
HELA-CD4-IFFA
UND
DEM
MT4-PA
.
62
3.3.2
AZT-SENSITIVITAETSTEST
MIT
DEM
MT4-CA
.
63
3.3.3
AZT-SENSITIVITAETSTEST
MIT
DEM
PBL-CA
.
63
3.4
FLUORESZENZZYTOMETRIE
(FACS)
.
65
3.5
ANWENDUNG
DES
HELA-CD4-IFFA
AUF
HIV-ISOLATE
VON
PATIENTEN
EINER
DDL-BEHANDLUNGSSTUDIE
.
67
3.5.1
TITRATIONEN,
AZT
UND
DDL-SENSITIVITAETSTESTS
DER
PATIENTEN-ISOLATE
AUS
DER
ZEIT
VOR
UND
NACH
(BZW.
WAEHREND)
DER
DDL-THERAPIE
.
67
3.5.2
KLINISCHE
DATEN
DER
PATIENTEN
IM
ZEITLICHEN
ZUSAMMMENHANG
MIT
DER
DDL-BEHANDLUNGSSTUDIE
.
.68
3.5.2.1
DIE
DDL-BEHANDLUNGSSTUDIE
.
69
3.5.2.2
KLINISCHE
DATEN
DER
FUENF
DDL-BEHANDELTEN
PATIENTEN.
.
70
3.5.2.2.1
"DDL-PATIENT"
NR.
6
(ABB.
19)
.
71
3.5.Z2.2
"DDL-PATIENT
"
NR.
11
(ABB.
20)
.
73
3.5.2.2.3
"DDL-PATIENT"
NR.
17
(ABB.
21)
.
75
3.5.2.2.4
"DDL-PATIENT"
NR.
22
(ABB.
22)
.
77
3.5.2.2.5
"DDL-PATIENT"
NR.
36
(ABB.
23)
.
78
3.5.2.2.6
ZUSAMMENFASSUNG
DER
PATIENTENDATEN.
.
86
4
DISKUSSION
89
5
ZUSAMMENFASSUNG
105
6
LITERATURVERZEICHNIS
107
7
BISHERIGE
VEROEFFENTLICHUNGEN
121
8
ANHANG
123
8.1
EINZELWERTTABELLEN
.
123
8.2
LEBENSLAUF.
.
125
XIV |
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| author | Murrenhoff, Christoph 1965- |
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