Genetische und molekularbiologische Charakterisierung von Komponenten der mitochondrialen Transkription in der Hefe Saccharomyces cerevisiae:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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1998
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INHALTSVERZEICHNIS
N
INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
1
2
MATERIAL
UND
METHODEN
10
2.1
CHEMIKALIEN
UND
ENZYME
10
2.2
HEFESTAEMME
*
*
2.2.1
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
H
2.2.2
SACCHAROMYCES
DOUGLASII
11
2.2.3
KLUYVEROMYCES
LACTIS
11
2.3
ESCHERICHIA
COLI
STAEMME
11
2.4
HEFEMEDIEN
12
2.5
ESCHERICHIA
COLI
MEDIEN
13
2.6
KLONIERUNGSVEKTOREN
14
2.7
VERWENDETE
PRIMER
14
2.8
MIKROBIOLOGIOSCHE
METHODEN
15
2.8.1
KREUZUNG
ZWEIER
STAEMME
15
2.8.2
ERSTELLUNG
EINER
WACHSTUMSKURVE
15
2.8.3
E.COLI
TRANSFORMATION
15
2.8.4
HEFETRANSFORMATION
(MODIFIZIERT
NACH
GIETZ
ET
AL.
1995)
15
2.8.5
KREUZUNG
DER
ZELLEN
FILR
DAS
2-HYBRID
SYSTEM
16
2.8.6
SPORULATION
UND
T
ETRADENANAIYSE
1
1
2.8.7
RANDOM
SPORENANALYSE
17
2.9
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
17
2.9.1
PLASMIDISOLATION
AUS
E.
COLI
(MODIFIZIERT
NACH
BIMBOIM
&
DOLY
1979)
17
2.9.2
DNA-RESTRIKTION
18
2.9.3
AGAROSEGELE
ZUR
AUFTRENNUNG
VON
DNA
FRAGMENTEN
18
2.9.4
AUFREINIGUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
18
2.9.5
DEPHOSPHOTYLIERUNG
UEBERHAENGENDER
5'-ENDEN
19
2.9.6
DNA-LIGATION
19
2.9.7
PLASMIDISOLATION
AUS
HEFE
(ABGEWANDELT
NACH
NASMYTH
&
REED
1980)
19
2.9.8
GESAMT-DNA
ISOLATION
AUS
HEFE
20
2.9.9
IN
VITRO
AMPLIFIKATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
DURCH
PCR
20
2.9.10
TRANSFER
DER
DNA
AUF
NITROCELLULOSEMEMBRAN
20
2.9.11
MARKIERUNG
EINER
DNA-SONDE
DURCH
RANDOM-PRIMING
21
2.9.12
MARKIERUNG
EINER
DNA-SONDE
DURCH
NICK-TRANSLATION
21
2.9.13
ENDMARKIERUNG
EINER
DNA-SONDE
DURCH
AUFIUELLEN
UEBERHAENGENDER
5
'-ENDEN
21
2.9.14
HYBRIDISIERUNG
FILTERGEBUNDENER
DNA
(MODIFIZIERT
NACH
SOUTHERN
1979)
22
2.9.15
GESAMT-RNA
ISOLATION
AUS
HEFE
22
2.9.16
GELELEKTROPHORESE
VON
RNA
22
INHALTSVERZEICHNIS
VI
2.9.17
TRANSFER
VON
RNA
AUF
NITROCELLULOSE
23
2.9.18
HYBRIDISIERUNG
FILTERGEBUNDENER
RNA
23
2.9.19
KOLONIEHYBRIDISIERUNG
24
2.9.20
DNA-SEQUENZIERUNG
(NACH
SANGER
1977)
24
2.10
PROTEINBIOCHEMISCHE
METHODEN
25
2.10.1
UEBEREXPRESSION
EINES
WISE-TAG
FUSIONSGENS
IN
CO/I
25
2.10.2
AUFREINIGUNG
EINES
IN
E
COFI
OBEREXPRIMIERTEN
TFTSA-TAG
FUSIONSPROTEINS
25
2.10.3
UEBEREXPRESSION
EINES
TFISA-TAG
FUSIONSGENS
IN
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
26
2.10.4
RENATURIERUNG
GEREINIGTER
TFEA-TAG
PROTEINE
(HAGER
&
BURGESS
1980)
26
2.10.5
GELRETARDATIONSTEST/VERZOEGERUNGSGEL
26
2.10.6
DNA-BINDEFAEHIGKEITSTEST
AUF
EINER
MEMBRAN
(SOUTH-WESTEM
BLOT)
27
2.10.7
ISOLATION
VON
GESAMTPROTEINEXTRAKTEN
AUS
HEFE
(YAFFE
&
SCHATZ
1984)
27
2.10.8
MITOCHONDRIENISOLATION
AUS
HEFE
(MODIFIZIERT
NACH
PRATJE
&
MICHAELIS
1977)
27
2.10.9
PROTEINASEK-BEHANDLUNG
VON
MITOCHONDRIEN
28
2.10.10
SDS-PAGE
VON
PROTEINEN
28
2.10.11
COOTNASSIE-FAERBUNG
VON
PROTEINGELEN
29
2.10.12
UEBERTRAGUNG
AUFGETRENNTER
PROTEINE
AUF
NITROCELLULOSE
DURCH
ELEKTROBLOT
29
2.10.13
IMMUNODEKORATION
FILTERGEBUNDENER
PROTEINE
29
2.10.14
CHEMILUMINESZENZREAKTION
30
2.10.15
MEERRETTICH-PEROXIDASE
REAKTION
31
2.11
MIKROSKOPISCHE
METHODEN
31
2.11.1
FLUORESZENZMIKROSKOPIE
VON
GFP
FUSIONSPROTEINEN
/DAPI-FAERBUNG
31
2.11.2
IMMUNELEKTRONENMIKROSKOPIE
31
3
ERGEBNISSE
33
3.1
CHARAKTERISIERUNG
EINER
PUNKTMUTANTE
FOER
DIE
MITOCHONDRIALE
RNA
POLYMERASE
DER
HEFE
33
3.1.1
KARTIERUNG
DER
MUTATION
34
3.1.2
SEQUENZIERUNG
DER
MUTIERTEN
REGION
34
3.1.3
DIE
MUTANTE
IST
NICHT
DURCH
MTF1
ODER
AZF1
IN
HOHER
KOPIENZAHL
SUPPRIMIERBAR
35
3.1.4
DIE
MUTIERTE
REGION
IST
SEHR
ANFAELLIG
FUER
IN
VITRO
AMPLIFIKATIONSFEHLER
38
3.2
CHARAKTERISIERUNG
EINES
SUPPRESSORS
FUER
DIE
MUTANTE
PET798
DER
MITOCHONDRIALEN
RNA
POLYMERASE
39
3.2.1
ZELLFRAKTIONIERUNG
VON
HEFEZELLEN
MIT
OEBEREXPRIMIERTEN
AZF1-HIS
6
39
3.2.2
HETEROLOGE
EXPRESSION
VON
AZFL-HIST
FUSIONSPROTEINEN
IN
E.
COLI
40
3.2.3
LOKALISATION
VON
AZFLP
DURCH
ZELLFRAKTIONIERUNG
43
3.2.4
IDENTIFIZIERUNG
EINES
SEQUENZMOTIVS
FUER
EIN
POTENTIELLES
KEMLOKALISATIONSSIGNAL
IN
AZFLP
43
3.2.5
LOKALISATION
VONAZFLP
DURCH
IMMUNOGOLD-ELEKTRONENMIKROSKOPIE
44
3.2.6
LOKALISATION
EINES
J Z/7P-GF7
-FUSIONSPROTEINS
DURCH
FLUORESZENZMIKROSKOPIE
46
3.2.7
ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE
ANALYSE
DER
DELETIONSMUTANTE
VON
AZF1
50
3.2.8
KONSTRUKTION
EINER
KOMPLETTEN
NIILLMNTANTE
FFLR
JZF1
53
3.2.9
TRANSKRIPTANALYSE
VOAAZFL
UNTER
8
VERSCHIEDENEN
PHYSIOLOGISCHEN
BEDINGUNGEN
56
3.2.10
PROTEINEXPRESSIONSSTUDIEN
VON
AZFLP
UNTER
8
VERSCHIEDENEN
PHYSIOLOGISCHEN
BEDINGUNGEN
58
3.2.11
TEST
AUF
DNA-BINDEFAEHIGKEIT
DES
FSSKD
AZFLP-HIS6
FRAGMENTS
IM
VERZOEGERUNGSGEL
59
INHALTSVERZEICHNIS
VH
3.2.12
TEST
AUF
DNA-BINDUNG
VON
AZFLP
UND
PGDLP
IM
SOUTH-WESTEM
BLOT
60
3.2.13
EINFLUSS
EINERJZFV
UEBEREXPRESSION
AUF
DIE
MTFLP-MASGE
61
3.2.14
TEST
AUF
WECHSELWIRKUNG
VON
AZFLP
MIT
ANDEREN
PROTEINEN
IM
2-HYBRID
SYSTEM
63
3.3
VERSUCHE
ZUR
IDENTIFIZIERUNG
EINES
HOMOLOGEN
GENS
DES
MITOCHONDRIALEN
SPEZIFITAETSFAKTORS
AUS
VERSCHIEDENEN
HEFEN
67
3.3.1
HYBRIDISIERUNG
RESTRINGIERTER
GESAMT-DNA
VON
K.LACTIS
67
3.3.2
KLONIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
DER
ERHALTENEN
DNA
BANDEN
68
3.3.3
KOLONIEHYBRIDISIERUNG EINER
GESAMT-DNA
GENBANK
AUS
SACCHAROMYCES
DOUGLASUE:
69
3.3.4
EXPRESSIONSAENDERUNGEN
DURCH
VERKUERZUNG
DES
5'-UNTRANSLATIERTEN
BEREICHS
VON
SCMTFL
70
3.3.5
SEQUENZIERUNG
UND
VERGLEICH
DER
5'-BEREICHE
DER
MTF1
GENE
VON
S.CEREVISIAE,
S.DOUGLASUE,
S.TIUYVERI
UND
KDACTIS
72
3.3.6
TRANSKRIPTEXPRESSIONSSTUDIEN
DER
GENE
SCMTFL,
SDMTF
1
UND
HMTF1
UNTER
GLUCOSEREPRESSIONS
UND
GALACTOSEBEDINGUNGEN
74
3.3.7
TEST
DER
WECHSELWIRKUNG
VON
AZFLP
MIT
DER
KONSERVIERTEN
5'-REGION
VON
SCMTFL
IM
1
HYBRID
SYSTEM
75
3.4
IN
VIVO
FUNKTIONSTEST
DER
FUER
DIE
MITOCHONDRIALE
TRANSKRIPTION
ESSENTIELLEN
FAKTOREN
IM
HETEROLOGEN
KOMPLEMENTATIONSANSATZ
77
3.4.1
TEST
AUF
HETEROLOGE
KOMPLEMENTATION
EINER
ARPOTL
MUTANTE
DURCH
DIE
PHAGENTYPISCHEN
RNA
POLYMERASEN
DER
MITOCHONDRIEN
(RPOY)
UND
PLASTIDEN
(RPOZ) VON
ARABIDOPSIS
THALIANA
77
3.4.2
KONSTRUKTION
VON
CHIMAEREN
PROTEINEN
AUS
RPO41P
UND
RPOYP/RPOZP
79
3.4.3
TEST
AUF
KOMPLEMENTATION
BEI
UEBEREXPRESSION
VON
MTF1
81
3.4.4
TEST
AUF
MTDNA-GEHALT
DER
TRANSFORMIERTEN
DISRUPTANTEN
82
3.4.5
TEST
AUF
AUSTAUSCHBARKEIT
DES
MITOCHONDRIALEN
SPEZIFITAETSFAKTORS
DURCH
HETEROLOGE
KOMPLEMENTATION
85
3.4.6
AUSTAUSCH
DER
5'-BEREICHE
VON
SCMTFL
UND
SDMTFL
85
3.4.7
NACHWEIS
DER
FUSIONSPROTEINE
MIT
EINEM
POLYKLONALEN
ANTIKOERPER
GEGEN
SCMTFLP
86
3.5
HETEROLOGER
KOMPLEMENTATIONSTEST
EINES
FUER
DIE
MITOCHONDRIALE
BIOGENESE
ESSENTIELLEN
FAKTORS
88
3.5.1
VERSUCH
ZUR
HETEROLOGEN
KOMPLEMENTATION
EINER
AMTFT
MUTANTE
DURCH
EINEN
MITOCHONDRIALEN
40KD
REPLIKATIONSTERMINATIONSFAKTOR
DES
SEEIGELS
88
4
DISKUSSION
90
4.1
IDENTIFIZIERUNG EINER
FUNKTIONELL
WICHTIGEN,
KONSERVIERTEN
DOMAENE
SPEZIFISCH
FUER
ORGANELLEN
RNA
POLYMERASEN
90
4.2
IDENTIFIZIERUNG
DES
MITOCHONDRIALEN
SPEZIFITAETSFAKTORS
FUER
DAS
CORE
ENZYM
DER
MITOCHONDRIALEN
RNA
POLYMERASE
AUS
SACCHAROMYCES
DOUGLASUE
93
4.3
CHARAKTERISIERUNG
DES
SUPPRESSORS
AZF1
FUER
DAS
MUTIERTE
CORE-ENZYM
DER
MITOCHONDRIALEN
RNA
POLYMERASE
DER
HEFE
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
97
4.4
HETEROLOGE
KOMPLEMENTATION
ALS
IN
VIVO
FUNKTIONSTEST
FUER
DIE
ESSENTIELLEN
FAKTOREN
DER
MITOCHONDRIALEN
TRANSKRIPTION
UND
REPLIKATION
103
4.4.1
DIE
MITOCHONDRIALE
RNA
POLYMERASE
104
4.4.2
DER
SPEZIFITAETSFAKTOR
106
4.4.3
MTF2/NAM1
107
5
ZUSAMMENFASSUNG
109
6
LITERATURVERZEICHNIS
HO
INHALTSVERZEICHNIS
VHI
7
DANKSAGUNG
126
8
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