Holdings: Genetische und molekularbiologische Charakterisierung von Komponenten der mitochondrialen Transkription in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Genetische und molekularbiologische Charakterisierung von Komponenten der mitochondrialen Transkription in der Hefe Saccharomyces cerevisiae:

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Main Author:	Stein, Torsten (Author)
Format:	Thesis Book
Language:	German
Published:	1998
Subjects:	Mitochondrium Transkription > Genetik Saccharomyces cerevisiae Hochschulschrift
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adam_text	INHALTSVERZEICHNIS N INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG 1 2 MATERIAL UND METHODEN 10 2.1 CHEMIKALIEN UND ENZYME 10 2.2 HEFESTAEMME * * 2.2.1 SACCHAROMYCES CEREVISIAE H 2.2.2 SACCHAROMYCES DOUGLASII 11 2.2.3 KLUYVEROMYCES LACTIS 11 2.3 ESCHERICHIA COLI STAEMME 11 2.4 HEFEMEDIEN 12 2.5 ESCHERICHIA COLI MEDIEN 13 2.6 KLONIERUNGSVEKTOREN 14 2.7 VERWENDETE PRIMER 14 2.8 MIKROBIOLOGIOSCHE METHODEN 15 2.8.1 KREUZUNG ZWEIER STAEMME 15 2.8.2 ERSTELLUNG EINER WACHSTUMSKURVE 15 2.8.3 E.COLI TRANSFORMATION 15 2.8.4 HEFETRANSFORMATION (MODIFIZIERT NACH GIETZ ET AL. 1995) 15 2.8.5 KREUZUNG DER ZELLEN FILR DAS 2-HYBRID SYSTEM 16 2.8.6 SPORULATION UND T ETRADENANAIYSE 1 1 2.8.7 RANDOM SPORENANALYSE 17 2.9 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 17 2.9.1 PLASMIDISOLATION AUS E. COLI (MODIFIZIERT NACH BIMBOIM & DOLY 1979) 17 2.9.2 DNA-RESTRIKTION 18 2.9.3 AGAROSEGELE ZUR AUFTRENNUNG VON DNA FRAGMENTEN 18 2.9.4 AUFREINIGUNG VON DNA-FRAGMENTEN 18 2.9.5 DEPHOSPHOTYLIERUNG UEBERHAENGENDER 5'-ENDEN 19 2.9.6 DNA-LIGATION 19 2.9.7 PLASMIDISOLATION AUS HEFE (ABGEWANDELT NACH NASMYTH & REED 1980) 19 2.9.8 GESAMT-DNA ISOLATION AUS HEFE 20 2.9.9 IN VITRO AMPLIFIKATION VON DNA-FRAGMENTEN DURCH PCR 20 2.9.10 TRANSFER DER DNA AUF NITROCELLULOSEMEMBRAN 20 2.9.11 MARKIERUNG EINER DNA-SONDE DURCH RANDOM-PRIMING 21 2.9.12 MARKIERUNG EINER DNA-SONDE DURCH NICK-TRANSLATION 21 2.9.13 ENDMARKIERUNG EINER DNA-SONDE DURCH AUFIUELLEN UEBERHAENGENDER 5 '-ENDEN 21 2.9.14 HYBRIDISIERUNG FILTERGEBUNDENER DNA (MODIFIZIERT NACH SOUTHERN 1979) 22 2.9.15 GESAMT-RNA ISOLATION AUS HEFE 22 2.9.16 GELELEKTROPHORESE VON RNA 22 INHALTSVERZEICHNIS VI 2.9.17 TRANSFER VON RNA AUF NITROCELLULOSE 23 2.9.18 HYBRIDISIERUNG FILTERGEBUNDENER RNA 23 2.9.19 KOLONIEHYBRIDISIERUNG 24 2.9.20 DNA-SEQUENZIERUNG (NACH SANGER 1977) 24 2.10 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 25 2.10.1 UEBEREXPRESSION EINES WISE-TAG FUSIONSGENS IN CO/I 25 2.10.2 AUFREINIGUNG EINES IN E COFI OBEREXPRIMIERTEN TFTSA-TAG FUSIONSPROTEINS 25 2.10.3 UEBEREXPRESSION EINES TFISA-TAG FUSIONSGENS IN SACCHAROMYCES CEREVISIAE 26 2.10.4 RENATURIERUNG GEREINIGTER TFEA-TAG PROTEINE (HAGER & BURGESS 1980) 26 2.10.5 GELRETARDATIONSTEST/VERZOEGERUNGSGEL 26 2.10.6 DNA-BINDEFAEHIGKEITSTEST AUF EINER MEMBRAN (SOUTH-WESTEM BLOT) 27 2.10.7 ISOLATION VON GESAMTPROTEINEXTRAKTEN AUS HEFE (YAFFE & SCHATZ 1984) 27 2.10.8 MITOCHONDRIENISOLATION AUS HEFE (MODIFIZIERT NACH PRATJE & MICHAELIS 1977) 27 2.10.9 PROTEINASEK-BEHANDLUNG VON MITOCHONDRIEN 28 2.10.10 SDS-PAGE VON PROTEINEN 28 2.10.11 COOTNASSIE-FAERBUNG VON PROTEINGELEN 29 2.10.12 UEBERTRAGUNG AUFGETRENNTER PROTEINE AUF NITROCELLULOSE DURCH ELEKTROBLOT 29 2.10.13 IMMUNODEKORATION FILTERGEBUNDENER PROTEINE 29 2.10.14 CHEMILUMINESZENZREAKTION 30 2.10.15 MEERRETTICH-PEROXIDASE REAKTION 31 2.11 MIKROSKOPISCHE METHODEN 31 2.11.1 FLUORESZENZMIKROSKOPIE VON GFP FUSIONSPROTEINEN /DAPI-FAERBUNG 31 2.11.2 IMMUNELEKTRONENMIKROSKOPIE 31 3 ERGEBNISSE 33 3.1 CHARAKTERISIERUNG EINER PUNKTMUTANTE FOER DIE MITOCHONDRIALE RNA POLYMERASE DER HEFE 33 3.1.1 KARTIERUNG DER MUTATION 34 3.1.2 SEQUENZIERUNG DER MUTIERTEN REGION 34 3.1.3 DIE MUTANTE IST NICHT DURCH MTF1 ODER AZF1 IN HOHER KOPIENZAHL SUPPRIMIERBAR 35 3.1.4 DIE MUTIERTE REGION IST SEHR ANFAELLIG FUER IN VITRO AMPLIFIKATIONSFEHLER 38 3.2 CHARAKTERISIERUNG EINES SUPPRESSORS FUER DIE MUTANTE PET798 DER MITOCHONDRIALEN RNA POLYMERASE 39 3.2.1 ZELLFRAKTIONIERUNG VON HEFEZELLEN MIT OEBEREXPRIMIERTEN AZF1-HIS 6 39 3.2.2 HETEROLOGE EXPRESSION VON AZFL-HIST FUSIONSPROTEINEN IN E. COLI 40 3.2.3 LOKALISATION VON AZFLP DURCH ZELLFRAKTIONIERUNG 43 3.2.4 IDENTIFIZIERUNG EINES SEQUENZMOTIVS FUER EIN POTENTIELLES KEMLOKALISATIONSSIGNAL IN AZFLP 43 3.2.5 LOKALISATION VONAZFLP DURCH IMMUNOGOLD-ELEKTRONENMIKROSKOPIE 44 3.2.6 LOKALISATION EINES J Z/7P-GF7 -FUSIONSPROTEINS DURCH FLUORESZENZMIKROSKOPIE 46 3.2.7 ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE ANALYSE DER DELETIONSMUTANTE VON AZF1 50 3.2.8 KONSTRUKTION EINER KOMPLETTEN NIILLMNTANTE FFLR JZF1 53 3.2.9 TRANSKRIPTANALYSE VOAAZFL UNTER 8 VERSCHIEDENEN PHYSIOLOGISCHEN BEDINGUNGEN 56 3.2.10 PROTEINEXPRESSIONSSTUDIEN VON AZFLP UNTER 8 VERSCHIEDENEN PHYSIOLOGISCHEN BEDINGUNGEN 58 3.2.11 TEST AUF DNA-BINDEFAEHIGKEIT DES FSSKD AZFLP-HIS6 FRAGMENTS IM VERZOEGERUNGSGEL 59 INHALTSVERZEICHNIS VH 3.2.12 TEST AUF DNA-BINDUNG VON AZFLP UND PGDLP IM SOUTH-WESTEM BLOT 60 3.2.13 EINFLUSS EINERJZFV UEBEREXPRESSION AUF DIE MTFLP-MASGE 61 3.2.14 TEST AUF WECHSELWIRKUNG VON AZFLP MIT ANDEREN PROTEINEN IM 2-HYBRID SYSTEM 63 3.3 VERSUCHE ZUR IDENTIFIZIERUNG EINES HOMOLOGEN GENS DES MITOCHONDRIALEN SPEZIFITAETSFAKTORS AUS VERSCHIEDENEN HEFEN 67 3.3.1 HYBRIDISIERUNG RESTRINGIERTER GESAMT-DNA VON K.LACTIS 67 3.3.2 KLONIERUNG UND SEQUENZIERUNG DER ERHALTENEN DNA BANDEN 68 3.3.3 KOLONIEHYBRIDISIERUNG EINER GESAMT-DNA GENBANK AUS SACCHAROMYCES DOUGLASUE: 69 3.3.4 EXPRESSIONSAENDERUNGEN DURCH VERKUERZUNG DES 5'-UNTRANSLATIERTEN BEREICHS VON SCMTFL 70 3.3.5 SEQUENZIERUNG UND VERGLEICH DER 5'-BEREICHE DER MTF1 GENE VON S.CEREVISIAE, S.DOUGLASUE, S.TIUYVERI UND KDACTIS 72 3.3.6 TRANSKRIPTEXPRESSIONSSTUDIEN DER GENE SCMTFL, SDMTF 1 UND HMTF1 UNTER GLUCOSEREPRESSIONS UND GALACTOSEBEDINGUNGEN 74 3.3.7 TEST DER WECHSELWIRKUNG VON AZFLP MIT DER KONSERVIERTEN 5'-REGION VON SCMTFL IM 1 HYBRID SYSTEM 75 3.4 IN VIVO FUNKTIONSTEST DER FUER DIE MITOCHONDRIALE TRANSKRIPTION ESSENTIELLEN FAKTOREN IM HETEROLOGEN KOMPLEMENTATIONSANSATZ 77 3.4.1 TEST AUF HETEROLOGE KOMPLEMENTATION EINER ARPOTL MUTANTE DURCH DIE PHAGENTYPISCHEN RNA POLYMERASEN DER MITOCHONDRIEN (RPOY) UND PLASTIDEN (RPOZ) VON ARABIDOPSIS THALIANA 77 3.4.2 KONSTRUKTION VON CHIMAEREN PROTEINEN AUS RPO41P UND RPOYP/RPOZP 79 3.4.3 TEST AUF KOMPLEMENTATION BEI UEBEREXPRESSION VON MTF1 81 3.4.4 TEST AUF MTDNA-GEHALT DER TRANSFORMIERTEN DISRUPTANTEN 82 3.4.5 TEST AUF AUSTAUSCHBARKEIT DES MITOCHONDRIALEN SPEZIFITAETSFAKTORS DURCH HETEROLOGE KOMPLEMENTATION 85 3.4.6 AUSTAUSCH DER 5'-BEREICHE VON SCMTFL UND SDMTFL 85 3.4.7 NACHWEIS DER FUSIONSPROTEINE MIT EINEM POLYKLONALEN ANTIKOERPER GEGEN SCMTFLP 86 3.5 HETEROLOGER KOMPLEMENTATIONSTEST EINES FUER DIE MITOCHONDRIALE BIOGENESE ESSENTIELLEN FAKTORS 88 3.5.1 VERSUCH ZUR HETEROLOGEN KOMPLEMENTATION EINER AMTFT MUTANTE DURCH EINEN MITOCHONDRIALEN 40KD REPLIKATIONSTERMINATIONSFAKTOR DES SEEIGELS 88 4 DISKUSSION 90 4.1 IDENTIFIZIERUNG EINER FUNKTIONELL WICHTIGEN, KONSERVIERTEN DOMAENE SPEZIFISCH FUER ORGANELLEN RNA POLYMERASEN 90 4.2 IDENTIFIZIERUNG DES MITOCHONDRIALEN SPEZIFITAETSFAKTORS FUER DAS CORE ENZYM DER MITOCHONDRIALEN RNA POLYMERASE AUS SACCHAROMYCES DOUGLASUE 93 4.3 CHARAKTERISIERUNG DES SUPPRESSORS AZF1 FUER DAS MUTIERTE CORE-ENZYM DER MITOCHONDRIALEN RNA POLYMERASE DER HEFE SACCHAROMYCES CEREVISIAE 97 4.4 HETEROLOGE KOMPLEMENTATION ALS IN VIVO FUNKTIONSTEST FUER DIE ESSENTIELLEN FAKTOREN DER MITOCHONDRIALEN TRANSKRIPTION UND REPLIKATION 103 4.4.1 DIE MITOCHONDRIALE RNA POLYMERASE 104 4.4.2 DER SPEZIFITAETSFAKTOR 106 4.4.3 MTF2/NAM1 107 5 ZUSAMMENFASSUNG 109 6 LITERATURVERZEICHNIS HO INHALTSVERZEICHNIS VHI 7 DANKSAGUNG 126 8 LEBENSLAUF 128
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