Molekulare Mechanismen der durch Eisenmangel induzierten Expression transferrinbindender Proteine von Actinobacillus pleuropneumoniae:
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1998
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
13
2
SCHRIFTTUM
15
2.1
ACTINOBACILLUS
PLEUROPNEUMONIAE
.
15
2.1.1
BEDEUTUNG
UND
VERBREITUNG
.
15
2.1.2
TAXONOMIE
.
16
2.1.3
INFEKTION
UND
IMMUNITAET
.
17
2.1.4
VIRULENZFAKTOREN
.
18
2.1.4.1
ADHAESINE
.
18
2.1.4.2
KAPSEL
.
19
2.1.4.3
LIPOPOLYSACCHARIDE
.
20
2.1.4.4
RTX-TOXINE
.
21
2.1.4.5
AEUSSERE-MEMBRAN-PROTEINE
(OMP)
.
22
2.1.4.6
WEITERE
FAKTOREN
.
23
2.1.5
KLINIK
.
24
2.1.6
PATHOLOGIE
UND
PATHOGENESE
.
25
2.1.7
THERAPIE
UND
PROPHYLAXE
.
29
2.2
REGULATION
DER
EXPRESSION
BAKTERIELLER
VIRULENZFAKTOREN
.
32
2.2.1
MOLEKULARE
REGULATION
VON
VIRULENZFAKTOREN
.
32
2.2.1.1
ZWEI-KOMPONENTEN-REGULATIONSSYSTEME
.
32
2.2.1.2
DIE
ARAC-FAMILIE
-
AKTIVATOREN
DER
TRANSKRIPTION
.
33
2.2.1.3
DIE
LYSR-FAMILIE
.
34
2.2.1.4 SIGMA-FAKTOREN
.
34
2.2.1.5
YYQUORUM
SENSING
"
.
35
2.2.1.6
GEGENSINN-RNA
(ANTI-SENSE-RNA)
.
36
2.2.1.7
DNA
TOPOLOGIE
.
36
2.2.1.8
RNA-STABILISIERUNG
.
37
2.2.2
UMWELTSIGNALE
REGULIEREN
DIE
EXPRESSION
BAKTERIELLER
VIRULENZFAKTOREN
.
39
2.2.2.1
TEMPERATUR
.
39
2.2.2.2
OSMOLARITAET
.
39
2.2.2.3
OXIDATIVER
STRESS
.
40
2.2.2.4
PH-WERT
.
41
2.2.2.5
SPEZIFISCHE
PRODUKTE
DES
WIRTS
.
41
2.2.3
EISEN
.
42
2.2.3.1
DIE
ROLLE
VON
EISEN
BEI
DER
INTERAKTION
VON
WIRT
UND
BAKTERIUM
.
43
2.2.3.1.1
EISENLIMITIERUNG
IM
WIRT
.
43
2.2.3.1.2
EISENAUFNAHME
BEI
BAKTERIEN
.
44
2.2.3.2
MOLEKULARE
MECHANISMEN
EISENREGULIERTER
GENE
.
47
2.2.3.2.1
REGULATION
DURCH
DEN REPRESSOR
FUER
.
47
2.23.2.2
POSITIVE
REGULATION
DER
EXPRESSION
EISENREGULIERTER
GENE
.
49
2.23.23
POSTTRANSKRIPTIONELLE
KONTROLLE
EISENREGULIERTER
GENE
.
50
3
MATERIAL
UND
METHODEN
53
3.1
BAKTERIEN
.
53
3.1.1
KULTIVIERUNGSBEDINGUNGEN
.
54
3.1.2
ERMITTLUNG
DER
ZELLDICHTE
.
55
3.1.3
KULTURKONSERVIERUNG
.
55
3.2
VEKTOREN
UND
PLASMIDE
.
55
3.3
PLASMIDKONSTRUKTIONEN
.
57
3.3.1
PLASMIDPRAEPARATIONEN
.
57
3.3.1.1
PLASMID-MINIPRAEPARATION
.
57
3.3.1.2
PLASMID-MIDI-PRAEPARATION
MIT
DEM
JET-STAR
MIDI-PREP-KIT*
.
58
3.3.1.3
PLASMIDPRAEPARATION
MIT
CSCL-GRADIENTEN-ZENTRIFUGATION
.
59
3.3.2
RESTRIKTIONSENZYMVERDAU
.
61
3.3.3
AGAROSEGELELKTROPHORESE
.
61
3.3.4
ELUTION
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
.
62
3.3.5
LIGATION
.
62
3.3.6
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
BAKTERIENZELLEN
.
62
3.3.7
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
MIT
PLASMID-DNA
.
63
3.4
PRAEPARATION
CHROMOSOMALER
DNA
.
63
3.5
DNA-SEQUENZ-ANALYSE
.
64
3.5.1
GEWINNUNG
DER
RF-FORM
DES
M13-VEKTORS
.
64
3.5.2
SUBKLONIERUNG
IN
M13MPL8
UND
M13MPL9
.
65
3.5.3
PRAEPARATION
EINZELSTRAENGIGER
M13-PHAGEN
DNA
.
65
3.5.4
SEQUENZIERUNG
.
66
3.5.5
COMPUTERANALYSE
DER
SEQUENZEN
.
66
3.6
SOUTHERN
BLOTTING
.
67
3.6.1
PRAEPARATION
32
P-MARKIERTER
GENSONDEN
.
67
3.6.2
SOUTHERN
HYBRIDSIERUNG
.
67
3.7
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
.
68
3.8
HERSTELLUNG
EINES
DOPPELSTRAENGIGEN
OLIGONUKLEOTIDS
.
69
3.9
UNTERSUCHUNG
VON
RNA
.
69
3.9.1
PRAEPARATION
BAKTERIELLER
RNA
.
69
3.9.2
RNA-STABILITAETS-TEST
.
70
3.9.2.1
DNASE-BEHANDLUNG
.
70
3.9.2.2
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
RNA
.
71
3.9.2.3
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
VON
GLYOXALDENATURIERTER
RNA
.
71
3.9.2.4
NORTHERN
BLOTTING
.
71
3.9.2.5
NORTHERN
ANALYSE
.
71
3.9.3
REVERSE
TRANSKRIPTASE-PCR
.
72
3.9.3.1
ERSTSTRANG-SYNTHESE
.
72
3.9.3.2
RNASE-BEHANDLUNG
.
73
3.9.3.3
RT-POLYMERASE-KETTENREAKTION
(RT-PCR)
.
73
3.10
MINIZELLANALYSEN
.
73
3.10.1
MINIZELLPRAEPARATION
AUF
SACCHAROSEGRADIENTEN
.
73
3.10.1.1
HERSTELLUNG
DER
SACCHAROSEGRADIENTEN
.
74
3.10.2
MINIZELLPRAEPARATION
.
74
3.10.3
35
S-METHIONIN-MARKIERUNG
VON
MINIZELLEN
.
74
3.11
GEWINNUNG
VON
KANINCHEN-HYPERIMMUNSERUM
.
75
3.11.1
PROTEINAGGREGATPRAEPARATION
.
75
3.11.2
MESSUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
MIT
DEM
BIORAD
DC
PROTEIN-ASSAY
.
76
3.11.3
IMMUNISIERUNG
VON
KANINCHEN
MIT
PROTEINAGGREGAT
.
76
3.11.4
MULTISCREEN-TEST
ZUR
UEBERPRUEFUNG
DER
SEROKONVERSION
.
76
3.11.5
AUFREINIGUNG
DES
SERUMS
UEBER
CNBR-AKTIVIERTE
SEPHAROSE
.
77
3.11.6
AUFREINIGUNG
DES
SERUMS
UEBER
PROTEIN
A-SEPHAROSE
.
77
3.11.7
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
78
3.11.8
VORBEREITUNG
DER
PROBEN
FUER
DIE
SDS-PAGE
.
78
3.11.9
COOMASSIE-BLAU-FAERBUNG
.
79
3.12
WESTERN
BLOTTING
.
79
3.12.1
PROTEINTRANSFER
VON
SDS-GELEN
IM
TANKBLOTTING-VERFAHREN
.
79
3.12.2
NACHWEIS
IMMUNOGENER
PROTEINE
.
80
3.12.3
ENZYMBLOT
.
81
3.12.4
IMMUNO-KOLONIE-BLOT
.
81
3.13
ZWEIDIMENSIONALE
GELELEKTROPHORESE
.
82
3.13.1.1
PROBENAUFBEREITUNG
(2DGE)
.
82
3.13.1.2
ERSTE
DIMENSION
(ISOELEKTRISCHE
FOKUSIERUNG)
.
82
3.13.1.3
ZWEITE
DIMENSION
(SDS-PAGE)
.
83
3.14
A.
PP.
-WACHSTUMSVERSUCH
.
83
3.15
REPORTERGENANALYSEN
.
84
3.15.1
ANZUCHT
AUF
INDIKATORAGAR
.
85
3.15.2
ALKALISCHE-PHOSPHATASE-TEST
.
85
3.15.3
AUSWERTUNG
DER
MESSDATEN
.
85
4
ERGEBNISSE
87
4.1
UNTERSUCHUNGEN
DES
5'
VON
TFBA
LIEGENDEN
ABSCHNITTS
DER
A.
PP.-DNA
.
87
4.1.1
NACHWEIS
DER
T/BA-MRNA
.
87
4.1.2
BESTIMMUNG
DES
TRANSKRIPTIONSSTARTPUNKTS
DER (FBA-MRNA
.
89
4.1.3
ERGEBNIS
DER
SEQUENZANALYSE
DER
1477
BASENPAARE
STROMAUFWAERTS
TFBA
.
92
4.1.4
ERGEBNIS
DER
DELETIONSANALYSE
DER
1477
BASENPAARE
STROMAUFWAERTS
TFBA
.
94
4.1.5
EINFLUSS
VON
E.
COLI-VVX
AUF
DIE
T/BA-TRANSKRIPTION
.
98
4.2
UNTERSUCHUNG
DES
REGULATORS
RHOAP
.
100
4.2.1
RESTRIKTIONSENZYMKARTEN
VON
PFRIOO
UND
PFR200
.
100
4.2.2
NACHWEIS
DER
PLASMIDSEQUENZEN
IM
CHROMOSOM
VON
A.
PP
.
102
4.2.3
ERGEBNIS
DER
SEQUENZIERUNG
VON
PFRIOO
UND
PFR200
.
104
4.2.3.1
NACHWEIS
DES
INSERTS
VON
PFR200
ALS EIN
ZUSAMMENHAENGENDER
ABSCHNITT
DES
A.
PP.
AP205A1-CHROMOSOMS.
110
4.2.4
ERGEBNISSE
DER
MINIZELLANALYSE
.
111
4.2.5
ANTIGENPRAEPARATION
ZUR
GEWINNUNG
VON
KANINCHEN-SERUM
GEGEN
RHOAP.
114
4.2.6
SEROLOGISCHER
NACHWEIS
VON
RHOAP
IM
WESTERN
BLOT
.
116
4.2.6.1
SPEZIFITAET
DES
SERUMS
GEGEN
RHOAP
.
116
4.2.6.2
SEROLOGISCHER
NACHWEIS
VON
RHOAP
IN
UNTER
VERSCHIEDENEN
WACHSTUMSBEDINGUNGEN
KULTIVIERTEN
A.
PP.
AP205A1
.
118
4.2.7
ZWEIDIMENSIONALE
DARSTELLUNG
VON
RHOAP
.
120
4.3
REGULATION
VON
TFBA
DURCH
RHOAP
.
122
4.3.1
DARSTELLUNG
DER
REPORTERGENAKTIVITAET
AUF
INDIKATORAGAR
.
122
4.3.2
DARSTELLUNG
VON
TFBA IM
IMMUNO
KOLONIE
BLOT
.
122
4.3.3
VERSTAERKUNG
DER
ALKALISCHEN-PHOSPHATASE-AKTIVITAET
DURCH
RHOAP
.
124
4.3.4
EINFLUSS
VON
RHOAP
AUF
DIE
TRANSLOKATION
VON
TFBA
.
126
4.3.5
POSTTRANSKRIPTIONELLER
EINFLUSS
VON
RHOAP
AUF
DAS
TFBAB-OPERON
.
128
4.3.6
STABILISIERUNG
DER
T/BA-MRNA
DURCH
RHOAP
.
132
5
DISKUSSION
135
6
ZUSAMMENFASSUNG
/
SUMMARV
145
7
LITERATURVERZEICHNIS
147
8
ANHANG
187
8.1
MEDIEN
UND
ZUSAETZE
.
187
8.2
LOESUNGEN
UND
PUFFER
.
188
8.2.1
PLASMID-MINIPRAEPARATION
.
188
8.2.2
PLASMIDPRAEPARATION
MIT
CSCL-GRADIENTEN-ZENTRIFUGATION
.
189
8.2.3
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
.
189
8.2.4
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
BAKTERIENZELLEN
.
189
8.2.5
PRAEPARATION
CHROMOSOMALER
DNA
.
189
8.2.6
PRAEPARATION
EINZELSTRAENGIGER
PHAGEN-DNA
.
189
8.2.7
PRAEPARATION
32
P-MARKIERTER
SONDEN
.
190
8.2.8
SOUTHERN-HYBRIDISIERUNG
.
190
8.2.9
HERSTELLUNG
EINES
DOPPELSTRAENGIGEN
OLIGONUKLEOTIDS
.
190
8.2.10
AGAROSEGELELKTROPHORESE
VON
GLYOXALDENATURIERTER
RNA
.
190
8.2.11
NORTHERN
ANALYSE
.
190
8.2.12
HERSTELLUNG
DER SACCHAROSEGRADIENTEN
.
191
8.2.13
MINIZELLPRAEPARATION
.
191
8.2.14
PROTEINAGGREGATPRAEPARATION
.
191
8.2.15
AUFREINIGUNG
DES
SERUMS
UEBER
CNBR-AKTIVIERTE
SEPHAROSE
.
191
8.2.16
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
192
8.2.17
VORBEREITUNG
DER
PROBEN
FUER
DIE
SDS-PAGE
.
192
8.2.18
COOMASSIE-BLAU-FAERBUNG
.
192
8.2.19
PROTEINTRANSFER
VON
SDS-GELEN
IM
TANKBLOTTING-VERFAHREN
.
192
8.2.20
NACHWEIS
IMMUNOGENER
PROTEINE
.
193
8.2.21
PROBENAUFBEREITUNG
(2DGE)
.
193
8.2.22
ERSTE
DIMENSION
(ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG)
.
193
8.2.23
ALKALISCHE-PHOSPHATASE-TEST
.
194
8.3
CHEMIKALIEN
.
195
8.4
ENZYME
.
197
8.5
PRIMER
.
198
8.6
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
.
201
8.7
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
203
DANKSAGUNG |
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