Strukturaufklärung und Charakterisierung neuartiger, membrangebundener Transportsysteme:
Gespeichert in:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
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1998
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| Beschreibung: | Heidelberg, Univ., Diss., 1998 (Nicht für den Austausch) |
| Beschreibung: | VI, 133 Bl. Ill., graph. Darst. |
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I
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN
DREI- UND EINBUCHSTABENCODE DER AMINOSAEUREN
1. EINLEITUNG
1.1 TRANSPORTSYSTEME IN BIOLOGISCHEN MEMBRANEN
1.2 TRANSPORTPROTEINE DER NIERE
1.3 STRUKTUR- UND FUNKTIONSAUFKLAERUNG MEMBRANGEBUNDENER TRANSPORTSYSTEME
1.4 ZIELE DER ARBEIT
2. MATERIAL UND METHODIK
2.1 MATERIAL
2.1.1 CHEMIKALIEN UND ENZYME
2.1.2 REAGENZIENSAETZE (KITS)
2.1.3 OLIGONULEOTIDE
2.1.4 BAKTERIENSTAEMME
2.1.5 PLASMIDVEKTOREN
2.1.6 RADIOCHEMIKALIEN
2.1.7 GERAETE
2.2 MIKROBIOLOGISCHE METHODEN
2.2.1 NAEHRMEDIEN
2.2.2 KULTUR UND LAGERUNG VON E.COLI
2.2.3 ELEKTROPORATION
2.3 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN
2.3.1 ROUTINEANWENDUNGEN
2.3.1.1
ALKOHOLPRAEZIPITATION VON
DNA
UND
RNA
2.3.1.2 PHENOL-CHLOROFORM-EXTRAKTION
2.3.1.3 MENGENBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN
2.3.2
AGAROSEGELELEKTROPHORESE NATIVER
DNA
2.3.3 ISOLIERUNG VON UV-GESCHUETZTER DNA AUS AGAROSE
2.3.4
AGAROSEGELELEKTROPHORESE DENATURIERTER
RNA
2.3.5 MODIFIKATION UND IN VITRO-REKOMBINATION VON DNA
2.3.5.1 RESTRIKTIONSANALYSE
IV
VI
1
2
6
11
12
12
12
12
12
13
13
14
14
14
15
16
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17
17
18
18
19
20
21
22
22
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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II
23
.
5.2 PHOSPHORYLIERUNG UND DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA-ENDEN 23
2.3.5.3 GLAETTUNG DER ENDEN MIT T4 DNA POLYMERASE 24
2.3.5.4 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN 24
2.3.5.5 KLONIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN 25
2.3.6 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA AUS E. COLI 26
2.3.7 PRAEPARATION VON RNA 26
2.3.8 POLY (A)
4-SELEKTION VON MRNA 28
2.3.9 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON DNA 29
2.3.10 ANALYSE VON RNA 32
2.3.10.1 NORTHERN-BLOTTING 32
2.3.10.2 NORTHERN-HYBRIDISIERUNG 33
2.3.11 CDNA-SYNTHESE 35
2.3.12 KOLONIEHYBRIDISIERUNG 36
2.3.13 REINIGUNG VON OLIGONUKLEOTIDEN 38
2.3.14 VERVIELFAELTIGUNG VON DNA DURCH DIE POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR) 39
2.3.14.1 ALLGEMEINE PCR-BEDINGUNGEN 39
2.3.14.2 KOLONIE-PCR
40
2.3.14.3 RNA-(RT)-PCR
41
2.3.14.4 INVERSE PCR
4~
2.3.15 DNA SEQUENZIERUNG
44
2.4 ZELLKULTUR
44
2.4.1 KULTIVIERUNG VON CAKI-1-ZELLEN
44
2.4.2 KULTIVIERUNG VON HEK 293-ZELLEN 43
2.4.3 TRANSIENTE TRANSFEKTION VON HEK 293-ZELLEN 45
2.4.4 STABILE TRANSFEKTION VON HEK 293-ZELLEN 46
2.4.5 INKUBATIONSVERSUCHE ZUR EXPRESSION TRANSFIZIERTER GENE 47
2.4.5.1 PROTEINBESTIMMUNG
4Y
2.5 SEQUENZANALYSE
4^
3. ERGEBNISSE
3.1 KLONIERUNG EINES TRANSPORTSYSTEMS AUS DER HUMANEN CAKI-L-ZELLINIE 50
3.1.1 IDENTIFIZIERUNG EINER HOMOLOGEN EST-SEQUENZ 50
3.1.2 SYNTHESE UND FRAKTIONIERUNG DER CDN A 51
3.1.3 EXPRESSIONSANALYSE FRAKTIONIERTER CAKI-1 -CDNA 54
3.1.4 ERSTELLUNG UND DURCHMUSTEM EINER CDNA-BIBLIOTHEK 56
3.1.4.1 LIGATIONSEFFIZIENZ IN ABHAENGIGKEIT VON ABSOLUTER UND RELATIVER
ENDENKONZENTRATION 56
3.1.4.2 ELEKTROTRANSFORMATION
III
3.1.4.3 KOLONIEHYBRIDISIERUNG 59
3.2 CHARAKTERISIERUNG VON UT2H 62
3.2.1 RESTRIKTIONSANALYSE UND SEQUENZIERUNG 62
3.2.2 SEQUENZCHARAKTCRISLIKA VON UT2H 62
3.2.3 RNA-(RT)-PCR AUS HUMANEM LEBERGEWEBC 65
3.3 KLONIERUNG EINES HOMOLOGEN TRANSPORTSYSTEMS AUS DER RATTENNIERE 67
3.3.1 PCR MIT DEGENERIERTEN KONSENSUSPRIMERN 67
3.3.2 ISOLIERUNG DER UT2R-EDNA 70
3.3.3 GEWINNUNG DES 5'-TERMINUS DER UT2R-EDNA 73
3.4 CHARAKTERISIERUNG VON UT2R 77
3.4.1 SEQUENZCHARAKTERISTIKA 77
3.4.2 GEWEBELOKALISATION VON UT2R-MRNA 80
3.4.2.1 RNA-(RT)-PCR-ANALYSE 80
3.4.2.2 NORTHEM-BLOTTING 82
3.5 FUNKTIONELLE EXPRESSION DES UT2-SYSTEMS 84
4. DISKUSSION
4.1 WEGE ZUR STRUKTURAUFKLAERUNG MEMBRANGEBUNDENER TRANSPORTSYSTEME 86
4.2 SYNTHESE UND KLONIERUNG VON CDNA 89
4.2.1 CDNA-SYNTHESE 89
4.2.2 FRAKTIONIERUNG UND PRAEPARATION DER CDNA 91
4.2.3 LIGATION UND TRANSFORMATION DER CDNA 92
4.2.4 IDENTIFIZIERUNG POSITIVER KLONE 93
4.3 KLONIERUNG DES 5'-GENTERMINUS MIT HILFE DER
POLYMERASE-KETTENREAKTION 95
4.4 CHARAKTERISIERUNG VON UT2H UND UT2R 97
4.4.1 SEQUENZSTUDIE 97
4.4.2 GE WEBE
VERTEILUNG
105
4.4.3 FUNKTIONELLE EXPRESSION 109
4.5 SCHLUSSFOLGERUNG UND AUSBLICK 112
5
. ZUSAMMENFASSUNG 114
6. LITERATUR
1
1
7. ANHANG
ANHANG 1 - NUKLEOTIDSEQUENZ DER UT2H-CDNA 131
ANHANG 2 - NUKLEOTIDSEQUENZ DER UT2R-CDNA 132 |
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