Design, Verwirklichung und funktional-evolutive Charakterisierung kooperativ gekoppelter Amplifikation in vitro:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
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1998
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1 EINLEITUNG
1
1.1 MOLEKULARE EVOLUTION.1
1.2 KOOPERATION UND EVOLUTION.2
1.3 ISOTHERMALE AMPLIFIKATIONSVERFAHREN UND FLUORIMETRISCHE ANALYSE.5
1.4 ZIELSTELLUNG DER ARBEIT.10
2 MATERIAL UND METHODEN.11
2.1 MATERIAL.II
2.1.1 CHEMIKALIEN
.II
2.1.2 ENZYME
.11
2.1.3 NUKLEINSAEUREN
.11
2.1.4 MIKROORGANISMEN
.12
2.1.5 PUFFER, MEDIEN UND STAMMLOESUNGEN
.12
2.2 METHODEN.13
2.2
.1 STAMMHALTUNG UND KULTIVIERUNG DER VERWENDETEN MIKROORGANISMEN.13
2.2.2 ISOLIERUNG, REINIGUNG UND KONZENTRIERUNG VON NUKLEINSAEUREN
.13
2.2.2.1 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA.13
2.2.22
ISOLIERUNG VON DNA- UND RNA-FRAGMENTEN AUS GELEN DURCH ELEKTROELUTION
MIT DER SALZFALLE .
.14
2.2.2.3 PHENOL/CHLOROFORM-EXTRAKTION.14
2.2.2.4 NUKLEINSAEUREPRAEZIPITATION DURCH NACL/ETHANOL-FAEILUNG.14
2.22.5
NUKLEINSAEUREREINIGUNG DURCH CHROMATOGRAPHIE UND GELFILTRATION.15
2.2.2.6 QUANTIFIZIERUNG DER NUKLEINSAEUREKONZENTRATION.15
2.2.3 NACHWEIS DER DNA STRUKTUR
.15
2.2.3.1 ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG IM AGAROSEGEL.15
2.2.3.2 ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG IN NATIVEN PA-GELEN.16
2.2.3.3 AUFTRENNUNG EINZELSTRAENGIGER NUKLEINSAEUREN IN DENATURIERENDEN
PA-GELEN.16
2.2.3.4 SEQUENZANALYSE NACH SAENGER.17
2.2.3.5 ELONGATION VON 51RD-41 ODER 5 '
,2P MARKIERTEN OLIGONUKLEOTIDEN.17
2.2.3.6 AUTORADIOGRAPHIE.17
2.2.4 IN VITRO MODIFIZIERUNG VON DNA
.18
2.2.4.1 FRAGMENTIERUNG DER DNA MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN.18
2.2.4.2 KOVALENTES VERKNUEPFEN VON DNA-FRAGMENTEN MIT T4-DNA-LIGASE.18
2.2.4.3 5'
12P-MARKIERUNG FREIER 5 'OH ENDEN MIT POLYNUKLEOTIDKINASE.18
2.2.4.4 KLENOW-BEHANDLUNG VON DNA.18
2.2.4.5 RNA-SPALTUNG MIT RNASEA.19
2.2.5 TRANSFER VON DNA IN E.COLI WIRTSZELLEN
.19
2.2.6 AMPLIFIKATION VON NUKLEINSAEUREN
.19
2.2.6.1 PCR-REAKTIONEN.19
2.2.6.2 3SR-REAKTIONEN.20
2.2.6.3 IN VITRO TRANSKRIPTION.21
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/955549078
2.2.6.4 IDA-REAKTIONEN.21
2.2.6.5 VERFOLGUNG VON IN VITRO AMPLIFIKATIONEN MIT DEM INTERKALATOR
TOPRO-1. MOLECUIAR BEACONS
UND DEM SUN-RISE-DETECTION SYSTEM IM FLUORIMETER.21
2.2.7
EXPRESSION, REINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON REKOMBINANTEN
PROTEINEN.22
2.2.7.1 KULTIVIERUNG, INDUKTION, ZELLGEWINNUNG UND -AUFSCHLUSS.22
2.2.7.2 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG NACH BRADFORD.22
2.2.13
KONZENTRIERUNG DURCH ULTRAFILTRATION.-.23
2.2.7.4 DENATURIERENDE SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE.23
2.2.7.5 REINIGUNG DER OEXHISTIDIN MODIFIZIERTEN ENZYME T7-RNA POLYMERASE,
HIV-1 RT, EIAV-
RT(WT) UND EIAV-RT(DL3).24
2.2.7.6 SAEULENCHROMATOGRAPHIE AN NI-NTA AGAROSE UND DEAE-SEPHAROSE FF.24
2.2.1.1
AKTIVITAETSTEST VON RNA- UND DNA-POLYMERASEAKTIVITAET.25
ERGEBNISSE.26
3.1 KONSTRUKTION EINES KOOPERATIV GEKOPPELTEN AMPLIFIKATIONSSCHEMAS.26
3.1.1 ABLEITUNG DES SCHEMAS FUER YYCOOPERATIVE AMPLIFICATION OF TEMPLATES
BY CROSS HYBRIDIZATION " -
CATCH VON DER 3SR-REAKTION
.26
3.1.2 KOMBINATIONSMOEGLICHKEITEN VON VERSCHIEDENEN SEQUENZMODULEN IM
CATCH-SCHEMA
.28
3.2 MECHANISTISCHE CHARAKTERISIERUNG UND NACHWEIS DER IN VITRO AKTIVITAET
DES HETERO- UND
HOMOPROMOTORSYSTEMS SOWIE DES RANDOM-DB/DB'-SYSTEMS.29
3.2.1 KONZENTRATIONSABHAENGIGKEIT DER HYBRIDISIERUNG VON DI UND D2
(SCHRITT I)
.29
3.2.2 ELONGATION DES HYBRIDISIERTEN DI/D2-KOMPLEXES DURCH RT (SCHRITT 2)
.31
3.2.3 LN VITRO TRANSKRIPTION DURCH T7-RNA POLYMERASE (SCHRITT 3)
.34
3.2.4 REVERSE TRANSKRIPTION DER RNAS RI UND R2 DURCH AMV-RT (SCHRITT 4)
.35
3.2.5 3SR-AMPLIFIKATION DES KOOPERATIV GEKOPPELTEN HETEROPROMOTORSYSTEMS
.36
3.2.6 AMPLIFIKATION DES HOMOPROMOTORSYSTEMS BEI UNTERSCHIEDLICHEN
BEDINGUNGEN
.38
3.2
.7 PARTIELLE RANDOMISIERUNG DER DB/DB '-REGION IM HOMOPROMOTORSYSTEM.41
3.2.8 KOOPERATIV GEKOPPELTE AMPLIFIKATION MIT PARTIELL RANDOMISIERTER
DB/DB -REGION
.43
3.2.9 SERIELLER TRANSFER DES HOMOPROMOTORSYSTEMS
.46
3.3 VERSCHIEDENE ENZYMSYSTEME FUER DIE OPTIMIERUNG VON CATCH.47
3.3.1 REINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER 6XHISTIDIN-MODIFIZIERTEN
T7-RNA POLYMERASE
.48
3.3.2 REINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON HIV-1, EIAV-RT(WT) UND
ELAV-RT(DL3)
.49
3.3.3 PRIMEREXTENSIONSREAKTIONEN MIT 5TRD-4I MARKIERTEN OLIGONUKLEOTIDEN
.51
3.3
.4 EINSATZ DER OEXHISTIDIN MODIFIZIERTEN POLYMERASEN FUER DIE
CATCH-AMPLIFIKATION.53
3.3.5 EINSATZ VON ELAV-RT(WT) UND ELAV-RT(DL3) IN DER
CATCH-AMPLIFIKATION
.58
3.4 KINETISCHE UND EVOLUTIVE CHARAKTERISIERUNG DES CATCH-SYSTEMS.60
3.4.1 KONTINUIERLICHE FLUORESZENZDETEKTION GEKOPPELTER AMPLIFIKATION MIT
TOPRO-1
.60
3.4.2 SEQUENZSPEZIFISCHE DETEKTION EINZELSTRAENGIGER
REAKTIONSINTERMEDIATE
.63
3.4.3 KONTINUIERLICHE FLUORESZENZDETEKTION DOPPELSTRAENGIGER DNA IN DER
CATCH-REAKTION
.69
3.4.4 KONTINUIERLICHE EVOLUTION DES CATCH-SYSTEMS UNTER HOMOGEN
GEMISCHTEN BEDINGUNGEN
.73
3.4.5 DAS EVOLVIERTE CATCH-SYSTEM AMPLIFIZIERT NACH EINEM DUALEN
MECHANISMUS
.81
3.4.6 STABILITAET DES DUALEN MECHANISMUS IM SERIELLEN TRANSFER
.85
3.5 ADDITIVE ISOTHERMALE AMPLIFIKATION.88
3.5.1 MECHANISMUS DER AUSBILDUNG VON PRIMERMULTIMEREN DURCH SCHRITTWEISE
VERLAENGERUNG
DOPPELSTRAENGIGER DNA-TEMPLATE
.88
3.5.2 AMPLIFIKATION EINER SPEZIFISCHEN TEMPLATSEQUENZ DURCH DIE
IDA-REAKTION
.90
3.5.3 UNTERSUCHUNG DES EINFLUSSES DER INITIATORSEQUENZ AUF DIE
IDA-REAKTION
.92
3.5.4 ZUR FUNKTIONSFAEHIGKEIT VON SEQUENZ- UND LAENGENDERIVATEN DES
STEM-LOOP INITIATORS.94
3.5.5 KOPPLUNG ZWISCHEN IDA-MECHANISMUS UND PCR-REAKTION. 98
3.5.6 SELEKTIVE UND GLEICHZEITIGE IDA-PCR VON DNA-GEMISCHEN
.100
3.5
.7 VERKNUEPFUNG DES IDA-MECHANISMUS MIT DER 3SR-REAKTION.101
3.5.8 SPONTANE BILDUNG EINES 3-ZYKLUS-SYSTEMS NACH DEM MUSTER DES
EVOLVIERTEN CATCH-SYSTEMS .104
3.5.9 SERIELLER TRANSFER AUSGEHEND VON UNTERSCHIEDLICHEN STARTTEMPLATEN
.108
3.5.10 IMPLEMENTIERUNG VON 3SR-AMPLIFIKATIONSREAKTIONEN IN
MIKROSTRUKTUREN AUF SILIZIUMBASIS.110
4
DISKUSSION.113
4.1
ZUR FUNKTIONALEN UND KINETISCHEN BETRACHTUNG DES CATCH-SYSTEMS.1
14
4.2 ZUR EVOLUTION DES CATCH-SYSTEMS
UNTER HOMOGEN GEMISCHTEN
BEDINGUNGEN.125
4.3 ZUR CHARAKTERISIERUNG
ISOTHERMALER NEBENREAKTIONEN
.130
4.3.1 EVOLUTIVER URSPRUNG UND SEQUENZABHAENGIGKEIT DER IDA-AKTIVITAET
.132
4.3.2 ANWENDUNGSMOEGLICHKEITEN DER IDA-REAKTION
.135
5
ZUSAMMENFASSUNG.139
6 LITERATUR
143 |
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