Nachweis von Punktmutationen des ras-Onkogens bei gut- und bösartigen kolorektalen und Harnblasentumoren mittels PCR, SSCP-, RFLP- und Sequenzanalysen:
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INHALTSVERZEICHNIS
KAPITEL
SEITE
1 EINLEITUNG 1-9
1.1 KANZEROGENESE 1
1.2 VIREN UND ONKOGENE 2
1.3 RAS-GENE 4
1.3.1 DAS RAS-GENPRODUKT (P21
RAS) 1
1.4 BEDEUTUNG DER MUTATIONSANALYSE 8
1.5 ZIEL DER ARBEIT 8
1.5.1 UNTERSUCHUNG DES KI-RAS-PROTOONKOGENS IN KOLOREKTALEN
TUMOREN 8
1.5.2 UNTERSUCHUNG DES HA-RAS-PROTOONKOGENS IN HARNBLASEN
TUMOREN
9
2 MATERIAL UND METHODEN 10-37
2.1 MATERIAL 10
2.1.1 GERAETE 10
2.1.2 CHEMIKALIEN UND ENZYME 11
2.1.3 ENZYM-PUFFER, LOESUNGEN UND HAEUFIG VERWANDTE PUFFER 13
2.1.3.1 ENZYM-PUFFER 13
2.1.3.2 LOESUNGEN 13
2.1.3.3 HAEUFIG VERWANDTE PUFFER 14
2.1.4 OLIGONUKLEOTIDE 14
2.2 METHODEN 15
2.2.1 MATERIALSAMMLUNG 15
2.2.2 EXTRAKTION DER DNA AUS FORMALINFIXIERTEN UND IN PARAFFIN
EINGEBETTETEN GEWEBSPROBEN 15
2.2.3 REINIGUNG DER DNA DURCH PHENOL/CHLOROFORM-EXTRAKTION 15
2.2.4 ALKOHOLISCHE FAELLUNG DER DNA 16
2.2.5 DNA-KONZENTRATIONS-UND REINHEITSBESTIMMUNG 16
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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2.2.6 POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR) 17
2.2.6.1 PCR FLIR DIE ANALYSE DER MUTATIONEN IN CODON 12 UND 13 DES
KI-RAS-GENS
19
2.2.6.1 1 NESTED-PCR EINES KI-RAS-GENABSCHNITTES FUER DIE SSCP-
ANALYSE
19
2.2.6.1.2 PCR DES KI-RAS-GENABSCHNITTES FUER DIE SEQUENZANALYSE 21
2.2.6.2 PCR FUER DIE ANALYSE DER MUTATIONEN IN CODON 12 UND 13
DES HA-RAS-GENS 22
2.2.7 GEL-ELEKTROPHORESE 23
2.2.7.1 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 23
2.2.7.2 POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 25
2.2.7.2.1 NICHT-DENATURIERENDE POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 25
2.2.7.2 2 DENATURIERENDE POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 26
2.2.8 SSCP-ANALYSE DER PCR-PRODUKTE DES KI-RAS-PROTOONKOGENS 26
2.2.8.1 VERSUCHSDURCHFUEHRUNG DER SSCP-ANALYSE 28
2.2.9 RFLP-ANALYSE DER PCR-PRODUKTE DES HA-RAS-GENS 29
2.2.9.1 VERSUCHSDURCHFUEHRUNG DER RFLP-ANALYSE 32
2.2.10 DNA-SEQUENZIERUNG NACH SAENGER 33
2.2.10.1 REINIGUNG UND PRAEPARATION VON BIOTIN-MARKIERTER SSDNA AUS
PCR-PRODUKTEN FUER DIE DIREKTE SEQUENZIERUNG 34
2.2.10.2 SEQUENZIERUNG MIT DER SEQUENASE VERSION 2.0 35
2.2.10.3 DENATURIERENDE POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE FUER DIE
AUFTRENNUNG DER SEQUENZIERREAKTION 36
2.2.10.3.1 VORBEREITUNG DER ELEKTROPHORESE-PLATTEN 36
2.2.10.3.2 GIESSEN DES SEQUENZIERGELS UND DIE GELELEKTROPHORESE 36
3 ERGEBNISSE 38-53
3.1 MORPHOLOGIE
38
3.1.1 KOLOREKTALE TUMOREN
3 8
3 12 INVASIVE UND NICHTINVASIVE TRANSITIONALZELLKARZINOME DER
HARNBLASE 38
3.2 ERGEBNISSE DER PCR-AMPLIFIKATION 42
3.2.1 PCR DES KI-RAS-GENABSCHNITTES 42
3.2.2 PCR DES HA-RAS-GENABSCHNITTES 43
3.3 ELEKTROPHORETISCHER NACHWEIS VON PUNKTMUTATIONEN 45
3.3.1 UNTERSCHIEDE DER SSCP-ANALYSE VON PCR-PRODUKTEN MIT
UND OHNE NESTED-PCR DES KI-RAS-GENS 45
3.3.2 RFLP-UNTERSUCHUNGEN VON PUNKTMUTATIONEN DES HA-RAS-
GENABSCHNITTES 48
3.4 SEQUENZANALYSEN 50
3.4.1 SEQUENZANALYSE DES KI-RAS-GENS 50
3.4.2 SEQUENZANALYSE DES HA-RAS-GENS 52
3.5 VERGLEICH DER MORPHOLOGIE MIT DEN MOLEKULARBIOLOGISCHEN
ANALYSEN 53
4 DISKUSSION 54-64
4.1 METHODIK DER MOLEKULARBIOLOGISCHEN MUTATIONSANALYSEN 54
4.1.1 OPTIMIERUNG DER PCR 55
4.1.1.1 ERGEBNISSE DER PCR DES KI-RAS-GENABSCHNITTES 56
41.1.2 ERGEBNISSE DER PCR DES HA-RAS-GENABSCHNITTES 57
4.1.2 MUTATIONSNACHWEIS DES KI-RAS-GENABSCHNITTES MITTELS SSCP-
ANALYSE 57
4.1.3 MUTATIONSNACHWEIS DES HA-RAS-GENABSCHNITTES MITTELS RFLP-
ANALYSE 59
4.2 GENETISCHE ALTERATIONEN BEI KOLOREKTALEN UND
HARNBLASENTUMOREN 60
4.2.1 KI-RAS-MUTATIONSHAEUFIGKEIT BEI KOLOREKTALEN TUMOREN 61
4.2.2 HA-RAS-MUTATIONSHAEUFIGKEIT BEI TRANSITIONALZELLKARZINOMEN DER
HARNBLASE 62
4.3 AUSBLICKE UND KLINISCHE RELEVANZ 63
5 ZUSAMMENFASSUNG 65-66
6 LITERATURVERZEICHNIS 67-77 |
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