Nachweis von Antikörpern gegen S. Enteritidis bei Masthähnchen mittels indirektem ELISA und Chemiluminiszenz-Immunoassay sowie einem S. Enteritidis-spezifischen Antigen:
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1997
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INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
T
ABELLENVERZEICHNIS
VERZEICHNIS
DER
ABBILDUNGEN
SEITE
1
EINLEITUNG
1
2
LITERATURUEBERSICHT
2
2.1
DIAGNOSTIK
DER
S.
ENTERITIDIS-INFEKTION
BEI
HUEHNERN
2
2.1.1
KULTURELLER
NACHWEIS
2
2.1.2
SEROLOGISCHE
UNTERSUCHUNG
2
2.1.2.1
AGGLUTINATIONSTEST
2
2.1.2.2
ENZYME
LINKED
IMMUNOSORBENT
ASSAY
(ELISA)
3
2.1.2.2.1
LPS-ELISA
5
2.1.2.2.2 FLAGELLAR-ANTIGEN-ELISA
6
2.1.2.2.3
OMPS-ELISA(AUSSENMEMBRANPROTEIN-ELISA)
8
2.1.2.2.4
FIMBRIEN-ANTIGEN-ELISA
8
2.2
EVALUIERUNG
DES
ELIS
AS
10
2.2.1
ELISA-PRINZIP
10
2.2.2
AUSWERTUNG
DER
ELISA-REAKTION
10
2.3
OPTIMIERUNG
DES
ELISAS
12
2.3.1
ELIMINIERUNG
VON
KREUZREAKTIONEN
12
2.3.2
CHEMILUMINESZENZ-IMMUNOASSAY
(CLIA)
13
2.3.2.1
GESCHICHTE
UND
ANWENDUNG
DER
CHEMILUMINESZENZ
13
2.3.2.2
REAKTIONSMECHANISMUS
15
2.3.2.3
LUMINOL-CHEMILUMINESZENZ
15
2.3.2.3.1
REAKTIONSMECHANISMUS
DER
LUMINOL-CHEMILUMINESZENZ
16
2.3.2.3.2
YYENHANCED
"
-CHEMILUMINESZENZ
17
2.3.3
VORTEILE
DER
CHEMILUMINESZENZ-IMMUNOASSAYS
20
3
EIGENE
UNTERSUCHUNGEN
21
3.1
MATERIAL
21
3.1.1
KEIME
21
3.1.1.1
AUSWAHLKRITERIUM
21
3.1.2
SEREN
21
3.1.2.1
REFERENZ-KONTROLLSEREN
21
3.1.2.2
SEREN
AUS
BAKTERIOLOGISCH
KONTROLLIERTEN
HUEHNERBESTAENDEN
22
3.1.3
ANDERE
VERWENDETE
REFERENZ-MATERIALIEN
24
3.1.4
MEDIEN
ZUR
ANTIGENHERSTELLUNG
24
3.1.5
GERAETE
ZUR
ANTIGEN-HERSTELLUNG
26
3.2
HERSTELLUNG
EINES
S.
ENTERITIDIS-SPEZIFISCHEN
ANTIGENS
26
3.2.1
KEIMANZUECHTUNG
26
3.2.2
GEWINNUNG
DES
S.
ENTERITIDIS-YY60C-ANTIGENS
"
26
3.2.3
FILTRATION
UND
KONZENTRATION
DES
ANTIGENS
26
3.2.4
QUALITAETSKONTROLLE
DES
ANTIGENS
28
3.2.4.1
BAKTERIOLOGISCHE
UEBERPRUEFUNG
28
3.2.4.2
PRUEFUNG
DER
REINHEIT
DES
ANTIGENS
MITTELS
SDS-PAGE
28
3.2.4.3
PRUEFUNG
DES
VORHANDENSEINS
VON
SEF14
MITTELS
SEFEX
R
-AGGLUTINATIONSTEST
29
3.2.4.4
BESTIMMUNG
DER
SPEZIFITAET
DES
FG-ANTIGENS
29
3.2.4.4.1
REAKTION
MIT
KANINCHEN-HYPERIMMUNSEREN
GEGEN
E.
COLI,
C.
FREUNDII,
S.
ENTERITIDIS,
S.
TYPHIMURIUM,
S.
GALLINARUM-PULLORUM,
S.
SUELLDORF
UND
S.
ORANIENBURG
29
3.2.4.4.2
REAKTION
MIT
ABGESAETTIGTEN
S.
ENTERITIDIS-,
S.
SUELLDORF-,
UND
S.
DUBLIN-KANINCHEN-HYPERIMMUNSEREN
29
3.2.4.4.3
REAKTION
MIT
SALMONELLA-FAKTORENSEREN
IM
INDIREKTEN
ELISA
32
3.2.4.4.4
SPEZIFITAETSBESTIMMUNG
IM
IMMUNOBLOTTING
32
3.2.5
LAGERUNG
33
3.3
INDIREKTER
ELISA
33
3.3.1
REAKTIONS-MEDIEN
FUER
DEN
ELISA
33
3.3.1.1
KONJUGATE
33
3.3.1.2
PUFFERLOESUNGEN
33
3.3.1.3
SUBSTRAT-INDIKATOR-LOESUNG
34
3.3.1.4
STOPLOESUNG
34
3.3.2
GERAETE
34
3.3.3
TESTDURCHFUEHRUNG
35
3.3.4
BELEGUNGSSCHEMA
FUER
DIE
MIKROTITERPLATTE
35
3.4
CHEMILUMINESZENZ-IMMUNOASSAY
(CLIA)
36
3.4.1
REAKTIONS-MEDIEN
FUER
DEN
CLIA
36
3.4.1.1
KONJUGAT
UND
PUFFERLOESUNGEN
36
3.4.1.2
SUBSTRAT-INDIKATOR-LOESUNG
36
3.4.2
GERAETE
37
3.4.3
TESTDURCHFUEHRUNG
(VORVERSUCHE)
37
3.4.3.1
BESTIMMUNG
DER
OPTIMALEN
KONZENTRATION
DER
YYENHANCED
"
LUMINOL-SUBSTRAT-INDIKATOR-LOESUNG
37
3.4.3.2
OPTIMIERUNG
DER
REAKTIONSMESSUNG
39
3.5
ANWENDUNG
DES
GEWONNENEN
S.
ENTERITIDIS-ANTIGENS
IM
INDIREKTEN
ELISA
UND
IM
CLIA
ZUR
SEROLOGISCHEN
UNTERSUCHUNG
VON
HUEHNERN
AUF
S
.
ENTERITIDIS-INFEKTIONEN
40
3.5.1
EINTEILUNG
DER
PROBESEREN
40
3.5.2
SCREENING-UNTERSUCHUNG
UND
IHRE
AUSWERTUNG
42
3.5.2.1
ERMITTLUNG
DER
NETTO-EXTINKTION
42
3.5.2.2
STANDARDISIERUNG
DER
TESTS
42
3.5.2.3
BESTIMMUNG
DER
GRENZWERTE
43
3.5.2.4
BESTIMMUNG
DER
SENSITIVITAET
UND
SPEZIFITAET
DES
ANTIGENS
IM
ELISA
UND
IM
CLIA
43
3.5.2.5
BEWERTUNG
DER
HERDEN
44
3.5.2.6
BEWERTUNG
DER
GRUPPEN
44
3.5.2.7.
BESTIMMUNG
DER
SIGNIFIKANTEN
UNTERSCHIEDE
ZWISCHEN
GRUPPEN
BZW.
SUBGRUPPEN
44
3.5.3
BESTIMMUNG
DES
ENDTITERS
DER
POSITIVEN
PROBEN
45
3.5.3.1
STANDARDISIERUNG
DER
TESTS
45
3.5.3.2
ERMITTLUNG
DES
ENDTITERS
45
3.5.4
UEBEREINSTIMMUNG
ZWISCHEN
CLIA
UND
ELISA
46
3.5.4.1
KAPPA-INDEX
46
3.5.4.2
REGRESSIONS-STATISTIK
47
4
ERGEBNISSE
48
4.1
SENSITIVITAET
UND
SPEZIFITAET
DER
EINGESETZTEN
ANTIGENE
48
4.1.1
60C-ANTIGEN
48
4.1.2
FG-ANTIGEN
52
4.2
CHARAKTERISIERUNG
DES
ANTIGENS
52
4.2.1
CHARAKTERISIERUNG
DES
ANTIGENS
MITTELS
SDS-PAGE
52
4.2.2
PRUEFUNG
DER
SPEZIFITAET
DES
FG-ANTIGENS
IM
INDIREKTEN
ELISA
52
4.2.3
BESTIMMUNG
DER
SPEZIFITAET
DES
FG-ANTIGENS
DURCH
IMMUNOBLOTTING
55
4.2.4
REAKTION
DES
FG-ANTIGENS
MIT
ABGESAETTIGTEN
KANINCHEN-
HYPERIMMUNSEREN
GEGEN
S.
ENTERITIDIS,
S.
SUELLDORF
UND
S.
DUBLIN
IM
INDIREKTEN
ELISA
57
4.2.4.1
ABGESAETTIGTES
S.
ENTERITIDIS-HYPERIMMUNSERUM
57
4.2.4.2
ABGESAETTIGTESS.
SUELLDORF-HYPERIMMUNSERUM
60
4.2.4.3
ABGESAETTIGTE
S.
DUBLIN-HYPERIMMUNSERUM
63
4.2.5
REAKTION
DES
FG-ANTIGENS
MIT
FAKTORENSEREN
IM
INDIREKTEN
ELISA
63
4.3
CHEMILUMINESZENZ-IMMUNOASSAY
(CLIA)
64
4.3.1
OPTIMIERUNG
DES
SIGNALVERSTAERKTEN
LUMINOLS
FUER
DEN
CLIA
64
4.3.2.
OPTIMIERUNG
DER
REAKTIONSMESSUNG
65
4.4
UNTERSUCHUNG
VON
HUEHNERN
AUF
EINE
S.
ENTERITIDIS-INFEKTION
UNTER
EINSATZ
DES
GEWONNENEN
S.
ENTERITIDIS-ANTIGENS
IM
ELISA
UND
IM
CLIA
67
4.4.1
SCREENING-UNTERSUCHUNG
67
4.4.1.1
STANDARDISIERUNG
DER
TESTS
67
4.4.1.2
DARSTELLUNG
DER
ERGEBNISSE
68
4.4.1.3
STATISTISCHE
GRUNDEIGENSCHAFTEN
DER
GRUPPEN
74
4.4.1.4 BERECHNUNG
DER
GRENZWERTE
UND
BEWERTUNG
DER
ERGEBNISSE
75
4.4.1.5
BESTIMMUNG
DER
SENSITIVITAET
UND
SPEZIFITAET
76
4.4.2
BESTIMMUNG
DER
PRAEVALENZ
76
4.4.3
BESTIMMUNG
DES
END-TITERS
78
4.4.3.1
STANDARDISIERUNG
DER
TESTS
78
4.4.3.2
DARSTELLUNG
DER
ERGEBNISSE
78
4.5.
SIGNIFIKANTE
UNTERSCHIEDE
ZWISCHEN
DEN
GRUPPEN
UND
HERDEN
81
4.5.1
SPEZIFITAET
81
4.5.2
INFEKTION
MIT
S.
ENTERITIDIS
(GRUPPE
I,
III)
82
4.5.3
INFEKTION
MIT
ANDEREN
SALMONELLA-SEROVAREN
(GRUPPE
II,
IV)
82
4.5.4
PASSIVE
IMMUNISIERUNG
83
4.6
DIAGNOSTISCHE
ANWENDBARKEIT
DES
FG-ANTIGENS
83
4.7
EVALUIERUNG
DER
KOLORIMETERISCHEN
UND
CHEMILUMINESZENTEN
IMMUNOASSAY
91
4.7.1
PRUEFUNG
DER
UEBEREINSTIMMUNG
ZWISCHEN
ELISA
UND
CLIA
MITTELS
KAPPA-INDEX
93
4.7.2
KORRELATION
ZWISCHEN
DEN
NORMALISIERTEN
EXTINKTIONSWERTEN
IM
ELISAUND
IM
CLIA
MIT
HILFE
DER
REGRESSION
93
5
DISKUSSION
98
5.1
ZIELSETZUNG
DER
VERSUCHE
98
5.2
HERSTELLUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DES
FG-ANTIGENS
98
5.3.
CHARAKTERISIERUNG
DES
ANTIGENS
99
5.3.1
FIMBRIEN-FRAKTION
99
5.3.2
GEISSEL-FRAKTION
100
5.3.3
AUSSENMEMBRANPROTEIN-FRAKTION
102
5.3.4
WEITERE
BESTANDTEILE
DES
FG-ANTIGENS
102
5.4
IMMUNOASSAY
S
103
5.3.1
INDIREKTER
ELISA
103
5.3.2
DER
YYENHANCED
"
CLIA
103
5.5
SEROLOGISCHE
UNTERSUCHUNG
VON
HUEHNERBESTAENDEN
AUF
EINE
S.
ENTERITIDIS-INFEKTION
104
5.5.1
STANDARDISIERUNG
DER
ERGEBNISSE
IN
DEN
VERWENDETEN
IMMUNOASSAYS
104
5.5.2
BEWERTUNG
DER
PROBE
BEIM
SCREENING
106
5.5.3
VERGLEICH
DER
ERGEBNISSE
DER
HERDEN-GRUPPEN
I-V
107
5.5.4
VERGLEICH
DER
ERGEBNISSE
DER
EINZELHERDEN
111
5.5.5
DIAGNOSTISCHE
ANWENDBARKEIT
DES
FG-ANTIGENS
113
5.6
DER
VERGLEICH
ZWISCHEN
ELISA
UND
CLIA
114
6
ZUSAMMENFASSUNG
117
7
SUMMARY
120
8
LITERATURVERZEICHNIS
123
9
ANHAENGE
132
10
DANKSAGUNG
11
LEBENSLAUF |
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| title_short | Nachweis von Antikörpern gegen S. Enteritidis bei Masthähnchen mittels indirektem ELISA und Chemiluminiszenz-Immunoassay sowie einem S. Enteritidis-spezifischen Antigen |
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