D-Aminosäureoxidase (EC 1.4.3.3) aus dem Pilz Fusarium oxysporum: Kultivierung, Induktion, Isolierung und Charakterisierung
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Clausthal-Zellerfeld
Papierflieger
1999
|
| Ausgabe: | 1. Aufl. |
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Zugl.: Braunschweig, Techn. Univ., Diss., 1998 |
| Beschreibung: | 224 S. Ill., graph. Darst. |
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
.
1
2
MATERIAL
UND
METHODEN
.
8
2.1
NOMENKLATUR
UND
MASSEINHEITEN
.
8
2.2
MIKROORGANISMUS
.
8
2.3
ENZYME
.
9
2.4
CHEMIKALIEN
.
9
2.5
MEDIEN
(D-AO)
.
10
2.5.1
MEDIUM
FUER
STICKSTOFFKONSERVEN
.
11
2.5.2
MEDIUM
ZUR
STAMMHALTUNG
AUF
AGARPLATTEN
.
11
2.5.3
MEDIUM
ZUR
SALZABHAENGIGKEIT
.
11
2.5.4
MEDIUM
ZUM
INDUKTORSCREENING
UND
ANZUCHT
IM
BIOREAKTOR
.
12
2.5.5
VITAMINLOESUNG
.
12
2.6
KULTURFUEHRUNG
.
13
2.6.1
STAMMHALTUNG
.
13
2.6.2
STAMMHALTUNG
AUF
AGARPLATTEN
.
13
2.6.3
KULTIVIERUNG
IM
SCHUETTELKOLBEN
.
13
2.6.4
KULTIVIERUNG
IM
BIOREAKTOR
.
14
2.7
BESTIMMUNG
DER
WACHSTUMSPARAMETER
.
15
2.7.1
BESTIMMUNG
DER
ZELLDICHTE
.
15
2.7.2
BESTIMMUNG
DER
BIOTROCKENMASSE
.
16
2.7.3
BESTIMMUNG
DER
GLUCOSEKONZENTRATION
.
16
2.7.4
BESTIMMUNG
DER
AMMONIUMKONZENTRATION
.
16
2.7.5
BESTIMMUNG
DER
MAXIMALEN
SPEZ.
WACHSTUMSRATE
P
M
AX
.
18
2.8
BESTIMMUNG
DER
D-AO-AKTIVITAET
.
18
2.8.1
O-DIANISIDIN/PEROXIDASE-ASSAY
.
19
2.8.2
POLAROGRAPHISCHE
BESTIMMUNG
DER
ENZYMAKTIVITAET
.
20
2.9 BESTIMMUNG
DER
KATALASE-AKTIVITAET
.
22
2.10
BESTIMMUNG
DER
D-SERINDEHYDRATASE-AKTIVITAET
.
23
2.11
PROTEINBESTIMMUNG
.
24
II
I
NHALTSVERZEICHNIS
2.12
AMINOSAEURE
UND
AMINOSAEUREDERIVATE-ANALYTIK
.
25
2.12.1
COLORIMETRISCHE
AMINOSAEURE-ANALYTIK
MITTELS
O-DIANISIDIN/
PEROXIDASE-ASSAY
.
25
2.12.2
AMINOSAEURE
UND
AMINOSAEUREDERIVATE-ANALYTIK
MITTELS
KAPILLARGASCHROMATOGRPHIE
.
27
2.12.2.1
DERIVATISIERUNF
MIT
ISOPROPANOL
UND
TFA
.
27
2.12.2.2
GASCHROMATOGRAPHIE
.
28
2.13
ZELLAUFSCHLUSS
.
28
2.13.1
ZELLAUFSCHLUSS
MITTELS
SCHWINGARMMUEHLE
MM2
.
29
2.13.2
ZELLAUFSCHLUSS
MITTELS
DYNO
MILL
.
29
2.14
AUFREINIGUNG
DER
D-AO
AUS
FUSARIUM
OXYSPORUM
.
30
2.14.1
AMMONIUMSULFATFAELLUNG
.
30
2.14.2
UMPUFFEM
MIT
PD-10-SAEULEN
.
31
2.14.3
FAST-PROTEIN-LIQUID-CHROMATOGRAPHY
(FPLC)
.
31
2.14.3.1
HYDROPHOBE
INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE
.
31
2.14.3.2
ANIONENAUSTAUSCHERCHROMATOGRAPHIE
.
32
2.15
EELKTROPHORETISCHE
UNTERSUCHUNGEN
.
32
2.15.1
NATIVE
GELELEKTROPHORESE
UND
AKTIV-FAERBUNG
.
32
2.15.2
SDS-GELELEKTROPHORESE
.33
2.15.3
ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG
(IEF)
.34
2.15.4
EICHPROTEINE
ZUR
BESTIMMUNG
DER
MOLMASSEN
DES
ISOELEKTRISCHEN
PUNKTES
.35
2.16
UNTERSUCHUNG
ZUR
GLYCOLYSIERUNG
DER
D-AO.36
2.16.1
SDS-GELELEKTROPHORES
MIT
"
MINI-PROTEAN
II
"
.36
2.16.2
WESTERN-BLOT
.37
2.17
AMINOSAEURESEQUENZ-BESTIMMUNG
.
37
2.18
AUFNAHME
VON
ABSORPTIONSSPEKTREN
.
37
2.18.1
HERSTELLUNG
DES
APO-ENZYMS
DER
D-AO
.
38
2.19
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
SUBSTRATSPEZIFITAET
DER
D-AO
.38
2.20
BESTIMMUNG
DES
TEMPERATUR
UND
PH-OPTIMUMS
.38
2.21
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
INHIBIERUNG
DER
D-AO.
39
2.22
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
STABILITAET
DER
D-AO
.
40
2.23
KOVALENTE
IMMOBILISIERUNG
DER
D-AO
AN
EUPERGIT
C
250
L
.
40
2.24
UNTERSUCHUNGEN
MIT
GANZEN
ZELLEN
.
41
I
NHALTSVERZEICHNIS
III
2.24.1
PERMEABILISIERUNG
VON
FUSARIUM
OXYSPORUM-ZETTEN
.
41
2.24.2
STABILISIERUNG
PERMEABILISIERTER
ZELLEN
VON
FUSARIUM
OXYSPORUM
.
41
2.25
UMSETZUNG
VON
D,L-METHIONIN
MITTELS
D-AO
AUS
FUSARIUM
OXYSPORUM
.
41
2.25.1
QUANTITATIVE
ANALYTIK
VON
A-KETO-/-METHIOLBUTYRAT
MITTELS
HPLC
.
42
2.26
QUANTITATIVER
NACHWEIS
VON
PYRUVAT
.
43
2.27
MEDIUM
ZUR
PRODUKTION
VON
BIKAVERIN
.
44
2.28
KULTURFUEHRUNG
BEI
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
BIKAVERIN-PRODUKTION
.
44
2.28.1
KULTIVIERUNG
IM
SCHUETTELKOLBEN
.
44
2.28.2
KULTIVIERUNG
IM
BIOREAKTOR
.
45
2.29
LYOPHILISIERUNG
DER
BIOMASSE
.
46
2.30
BIKAVERIN-ANALYTIK
.
46
2.30.1
BIKAVERIN-DETEKTION
MITTELS
HPLC
.
46
2.30.2
DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE
.
47
2.31
ISOLIERUNG
VON
BIKAVERIN
.
47
2.32
STRUKTURAUFKLAERUNG
.
48
2.32.1
ELEMENTARANALYSE
.
48
2.32.2
MASSENSPEKTROSKOPIE
.
48
2.32.3
NMR-SPEKTROSKOPIE
.
48
2.33
CHARAKTERISIERUNG
VON
BIKAVERIN
.
49
2.33.1
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
LOESLICHKEITSVERHALTEN
.
49
2.33.2
ANTIMIKROBIELLE
UNTERSUCHUNGEN
.
49
2.34
SYNTHESE
DER
SIGNALSUBSTANZEN
.
50
2.35
UMSETZUNG
DURCH
SS-LACTAMASEN
.
52
2.36
SCREENING
NACH
CEPHASEN
.
52
2.36.1
SCREENING
MEDIUM
.
53
2.36.2
KOMPLEX-MEDIUM
.
53
2.36.3
CEPHASE-ANALYTIK
.
54
IV
I
NHALTSVERZEICHNIS
3
ERGEBNISSE
-
D-AMINOSAEUREOXIDASE
.
55
3.1
UNTERSUCHUNG
ZUR
INDUKTION
DER
D-AMINOSAEUREOXIDASE
VON
FUSARIUM
OXYSPORUM
.
55
3.1.1
UNTERSUCHUNG
ZUR
INDUKTION
DER
D-AO
DURCH
ZUGABE
VON
D-AMINOSAEUREN
ALS
STICKSTOFF
BZW.
KOHLENSTOFFQUELLE
.
55
3.2
EINFLUSS
DES
PH-WERTES
AUF
DIE
INDUKTION
DER
D-AMINOSAEUREOXIDASE
.
58
3.3
EINFLUSS
VON
METALLSALZEN
AUF
DIE
INDUKTION
DER
D-AMINOSAEURE
OXIDASE
.
59
3.3.1
EINFLUSS
DER
ZN(LL)-KONZENTRATION
AUF
DIE
INDUKTION
DER
D-AMINOSAEUREOXIDASE
.
60
3.4
INDUKTOREN
DER
D-AMINOSAEUREOXIDASE
AUS
FUASRIUM
OXYSPORUM
.
61
3.4.1
EINFLUSS
VON
L-AMINOSAEUREN
AUF
DIE
INDUKTION
.
64
3.4.2
BESTIMMUNG
DER
OPTIMALEN
INDUKTORKONZENTRATION
FUER
D-ALANIN
UND
D-3-AMINOBUTTERSAEURE
.66
3.5
KULTIVIERUNG
VON
FUSARIUM
OXYSPORUM
IM
BIOREAKTOR
.67
3.5.1
KULTIVIERUNG
VON
FUSARIUM
OXYSPORUM
MIT
D,L-ALANIN
(80
MM)
ALS
INDUKTOR
.
69
3.5.2
KULTIVIERUNG
VON
FUSARIUM
OXYSPORUM
MIT
D,L-3-AMINO-
BUTTERSAEURE
(20
MM)
ALS
INDUKTOR
.
71
3.5.3
EINFLUSS
DES
POJ-GEHALTES
AUF
DIE
INDUKTION
DER
D-AO
AUS
FUSARIUM
OXYSPORUM
.
73
3.6
UNTERSUCHUNG
ZUR
AUFREINIGUNG
DER
D-AMINOSAEUREOXIDASE
AUS
FUSARIUM
OXYSPORUM
.
76
3.6.1
DESINTEGRATION
DER
ZELLEN VON
FUSARIUM
OXYSPORUM
.
77
3.6.2
AMMONIUMSULFATFAELLUNG
.
78
3.6.3
HYDROPHOBE
INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE
(HIC)
.
80
3.6.4
ANIONENAUSTAUSCHERCHROMATOGRAPHIE
.
81
3.6.4.1
RESOURCE
Q-SAEULE
(SALZGRADIENT
BEI
PH
6,0)
.
81
3.6.4.2
MONO
Q-SAEULE,
10/10
(SALZGRADIENT
BEI
PH
8,5)
.
83
3.6.4.3
MONO
Q-SAEULE,
5/5
(PH-GRADIENT)
.
84
3.6.5
ZUSAMMENFASSUNG
DER
AUFREINIGUNG
.
86
3.7
SCALE
UP
DER
AUFREINIGUNG
.
87
3.7.1
PRAEPARATIVE
AMMONIUMSULFATFAELLUNG
.
87
3.7.2
PRAEPARATIVE
HYDROPHOBE
INTERAKTIONSCHROMATOGRAFIE
.
87
I
NHALTSVERZEICHNIS
V
3.7.3
PRAEPARATIVE
ANIONENAUSTAUSCHERCHROMATOGRAPHIE
BEI
PH
6,0
.
88
3.7.4
PRAEPARATIVE
ANIONENAUSTAUSCHERCHROMATOGRAPHIE
MIT
SALZ-
UND
PH-GRADIENT
.
89
3.7.5
PRAEPARATIVE
ANIONENAUSTAUSCHERCHROMATOGRAPHIE
MIT
PH-GRADIENT
.
91
3.7.6
PRAEPARATIVE
ANIONENAUSTAUSCHERCHROMATOGRAPHIE
MIT
PH
GRADIENT
BEI
75
MM
KCL
.
92
3.7.7
ZUSAMMENFASSUNG
DER
AUFREINIGUNG
IM
PRAEPARATIVEN
MASSSTAB.
93
3.8
CHARAKTERISIERUNG
DER
D-AO
AUS
DEM
PILZ
FUSARIUM
OXYSPORUM
.
94
3.8.1
UNTERSUCHUNG
ZUR
REINHEIT
UND
BESTIMMUNG
DER
MOLMASSE
DER
D-AO
MITTELS
NATIVER
GELELEKTROPHORESE
.
94
3.8.2
UNTERSUCHUNG
ZUR
REINHEIT
UND
BESTIMMUNG
DES
MOLEKULAR
GEWICHTES
MITTELS
SDS-GELELEKTROPHORESE
.
95
3.8.3
BESTIMMUNG
DES
ISOELEKTRISCHEN
PUNKTES
(IP)
.
97
3.8.4
ZUSAMMENFASSUNG
DER
ELEKTROPHORETISCHEN
TRENNMETHODEN
.
98
3.8.5
UNTERSUCHUNG
ZUR
GLYCOLYSIERUNG
DER
D-AO
.
98
3.8.6
PARTIELLE
AZ-TERMINALE
SEQUNEZANALYSE
DER
D-AO
AUS
FUSARIUM OXYSPORUM
.
99
3.8.7
SPEKTROSKOPISCHE
EIGENSCHAFTEN
DER
D-AO
AUS
FUSARIUM
OXYSPORUM
.
100
3.8.8
PH-OPTIMUM
.
104
3.8.9
TEMPERATUR-OPTIMUM
.
105
3.9
SUBSTRATSPEZIFITAET
DER
D-AO
AUS
FUSARIUM
OYSPORUM
.
106
3.10
INHIBIERUNG
DER
D-AO.
108
3.11
STABILITAET
DER
D-AO.
112
3.11.1
TEMPERATURSTABILITAET
.
113
3.11.2
PH-STABILITAET
.
114
3.11.3
STABILITAET
DER
D-AO
IN
GEGENWART
VERSCHIEDENER
ADDITIVE
.
115
3.12
IMMOBILISIERUNG
DER
D-AO
AUS
FUSARIUM
OXYSPORUM
.
117
3.12.1
KOVALENTE
IMMOBILISIERUNG
DER
D-AO
AN
EUPERGIT
C
250
L
.
117
3.12.2
CHARAKTERISIERUNG
DER
IMMOBILISIERTEN
D-AO
.
119
3.13
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
EINSATZ
VON
IMMOBILISIERTER
D-AO
AUS
FUSARIUM
OXYSPORUM
AM
BEISPIEL
DER
UMSETZUNG
VON
D,L-METHIONIN.
121
VI
I
NHALTSVERZEICHNIS
3.14
EINSATZ
VON
GANZEN
ZELLEN
ALS
BIOKATALYSATOR
.
123
3.14.1
PERMEABILISIERUNG
DER
ZELLEN
VON
FUSARIUM
OXYSPORUM
.
123
3.14.2
STABILISIERUNG
PERMEABILISIERTER
ZELLEN
.
124
3.15
EINFLUSS
VON
H2O2
AUF
DIE
A-KETOSAEUREBILDUNG
.
125
4
ERGEBNISSE
-
BLKAVERIN
.
127
4.1
ISOLIERUNG
UND
STRUKTURAUFKLAERUNG
DES
ZIELPIGMENTES
.
128
4.1.1
DESINTEGRATION
DER
ZELLEN
VON
FUSARIUM
OXYSPORUM
.
128
4.1.2
ISOLIERUNG
DES
PIGMENTES
.
128
4.1.2.1
SUSPENSIONSEXTRAKTION
.
128
4.1.3
STRUKTURAUFKLAERUNG
.
129
4.1.3.1
ELEMENTARANALYSE
.
129
4.1.4.2
MASSENSPEKTROSKOPIE
.
130
4.1.3.3
NMR-SPEKTROSKOPIE
.
131
4.2
CHARAKTERISIERUNG
VON
BIKAVERIN
.
132
4.2.1
LOESLICHKEIT
.
132
4.2.2
ANTIMIKROBIELLE
UNTERSUCHUNGEN
.
133
4.3
HPLC-ANALYTIK
.
134
4.4
KULTIVIERUNG
IM
SCHUETTELKOLBEN
.
135
4.5
BIOREAKTORKULTIVIERUNG
.
138
4.5.1
PH-KONTROL)E
.
139
4.6
ZUSAMMENFASSUNG
DER
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
PIGMENTBILDUNG
BEI
FUSARIUM
OXYSPORUM
.
141
5
ERGEBNISSE
-
SCREENING
NACH
CEPHASEN
.
142
5.1
ENTWICKLUNG
EINER
SCREENING-METHODE
FUER
MIKROBIELLE
CEPHASEN
.
143
5.1.1
THEORETISCHE
UEBERLEGUNGEN ZUR
SIGNALSUBSTANZ
.
143
5.1.2
SYNTHESE
DER
SIGNALSUBSTANZEN
.
144
5.1.3
METABOLISIERUNG
DER
SUGNALSUBSTANZEN
DURCH
/2-LACTAMASEN
.
148
5.1.4
SELEKTIVITAET
DES
VERWENDETEN
MEDIUMS
.
148
5.2
SCREENING
NACH
CEPHASEN
.
151
5.3
AUSWERTUNG
DES
SCREENINGS
NACH
CEPHASEN
.
152
5.4
WACHSTUMSEXPERIMENTE
.
154
I
NHALTSVERZEICHNIS
VII
6
DISKUSSION
.
155
6.1
KULTIVIERUNG
UND
INDUKTION
DER
D-AO
AUS
FUSARIUM
OXYSPORUM
.
155
6.2
ISOLIERUNG
DER
D-AO
AUS
DEM
PILZ
FUSARIUM
OXYSPORUM
.
160
6.3
CHARAKTERISIERUNG
DER
D-AMINOSAEUREOXIDASE
.
163
6.4
STABILISIERUNG
UND
BIOTECHNOLOGISCHER
EINSATZ
DER
D-AO
.
170
6.5
BIKAVERIN
AUS
FUSARIUM
OXYSPORUM
.
172
6.6
SCREENING
NACH
CEPHASEN
.
175
7
ZUSAMMENFASSUNG
.
179
8
ABKUERZUNGEN
.
181
9
LITERATUR
.
183
10
ANHANG
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