Wirkung, Erkennung und Inaktivierung von Proteasen in der Haemolymphe der Großen Wachsmotte (Galleria mellonella): ein neuer Mechanismus der Fremderkennung im Immunsystem von Insekten
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1998
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INHALT
1.
EINLEITUNG
7
1.1
EINFUEHRUNG
IN
DIE
IMMUNOLOGIE
7
1.2
DAS
IMMUNSYSTEM
DER
INSEKTEN
8
1.2.1
DAS
INTEGUMENT
ALS
MECHANISCHE
BARRIERE
GEGEN
PATHOGENE
9
1.2.2
DIE
ZELLULAERE
IMMUNABWEHR
VON
INSEKTEN
10
-
PHAGOCYTOSE
11
-
ZELLULAERE
EINKAPSELUNG
UND
KNOETCHENBILDUNG
11
1.2.3
DIE
HUMORALE
IMMUNABWEHR
VON
INSEKTEN
12
1.3
INSEKTENPATHOGENE
PILZE
14
1.3.1
EINFUEHRUNG
14
1.3.2
PATHOGENESE
16
1.3.3
PILZTOXINE
19
1.4
WECHSELBEZIEHUNGEN
ZWISCHEN
INSEKTENPATHOGENEN
PILZEN
UND
IHREN
WIRTEN
20
2.
ZIELE
DIESER
ARBEIT
22
2.1
EFFEKTE
PILZLICHER
PROTEASEN
AUF
DIE
ZELLULAERE
IMMUNABWEHR
VON
GALLERIA
MELLONELLA
22
2.2
EFFEKTE
KAEUFLICHER
PROTEASEN
AUF
DIE
IMMUNANTWORT
VON
GALLERIA
MELLONELLA
24
2.3
ERKENNUNG
UND
INAKTIVIERUNG
NICHT-REGULIERTER
PROTEASEAKTIVITAET
IN
DER
HAEMOLYMPHE
VON
GALLERIA
MELLONELLA
25
2.4
CHARAKTERISIERUNG
DER
IMMUNSTIMULIERENDEN
3
KD-FAKTOREN
AUS
DER
ZELLFREIEN
HAEMOLYMPHE
VON
GALLERIA
MELLONELLA
25
3.
MATERIAL
UND
METHODEN
26
3.1
DAS
VERSUCHSTIER:
DIE
GROSSE
WACHSMOTTE
GALLERIA
MELLONELLA
26
3.1.1
BIOLOGIE
26
3.1.2
ENTWICKLUNG
27
3.1.3
HALTUNG
UND
ZUCHT
28
3.1.4
INJIZIEREN
UND
HAEMOLYMPHABNAHME
28
3.1.5
MORTALITAETSTESTS
29
3.2
CYTOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGEN
31
3.2.1
HAEMOCYTEN-PRAEPARATION
31
-
PRAEPARATION
VON
PLASMATOCYTEN
31
-
PRAEPARATION
UNSEPARIERTER
HAEMOCYTEN
31
-
PRAEPARATION
VON
GRANULAEREN
ZELLEN
32
3.2.2
ATTACHMENT-ASSAY
32
3.2.3
SPREADING-ASSAY
34
-
SPREADING
VON
PLASMATOCYTEN
34
-
SPREADING
GRANULAERER
ZELLEN
37
3.2.4
PHAGOCYTOSE-ASSAY
40
-
FLUORESZENZ-MARKIERUNG
UND
OPSONISIERUNG
VON
HEFEZELLEN
40
-
PHAGOCYTOSE-ASSAY
41
3.2.4
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
CYTOSKELETT
44
3.2.5
VITALITAETSTEST
(MTT-TEST)
44
3.3
MIKROBIOLOGISCHE
METHODEN
46
3.3.1
VERWENDETE
PILZE
46
3.3.2
VERWENDETE
BAKTERIEN
47
3.3.3
HERSTELLUNG
VON
NAEHRMEDIEN
UND
AGAR
47
-
KULTURMEDIEN
FUER
PILZE
47
-
KULTURMEDIEN
FUER
BAKTERIEN
50
3.3.4
GEWINNUNG
VON
INFEKTIONSMATERIAL
50
3.3.5
GEWINNUNG
UND
ANREICHERUNG
PROTEASEHALTIGER
PILZKULTURMEDIEN
52
3.3.6
QUANTITATIVE
LYSOZYMBESTIMMUNG
MITTELS
LYSISHOFTEST
54
3.3.7
QUANTITATIVE
BESTIMMUNG
DER
ANTIBAKTERIELLEN
AKTIVITAET
MITTELS
HEMMHOFTEST
58
3.4
BIOCHEMISCHE
METHODEN
62
3.4.1
QUANTITATIVE
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
BRADFORD
62
3.4.2
QUALITATIVE
UND
QUANTITATIVE
BESTIMMUNG
PROTEOLYTISCHER
AKTIVITAET
65
-
AZOCOLL-ASSAY
68
-
MILCHAGAR-PLATTENTEST
76
3.4.3
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
77
-
GELELEKTROPHORESE
77
-
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
78
-
SDS-POLYACRYLAMID-GRADIENTENGELE
78
-
COOMASSIE-F
AERBUNG
81
-
SILBERFARBUNG
82
3.4.4
METHODEN
ZUR
PROTEINFAELLUNG
83
-
HITZEFAELLUNG
83
2
-
TCA-FAELLUNG
84
3.4.5
METHODEN
ZUR
ANREICHERUNG
VON
PROTEINEN
85
-
DIALYSE
85
-
ULTRAFILTRATION
85
-
GEFRIERTROCKNUNG
(LYOPHILISATION)
86
-
SPEED-VAC
86
3.4.6
HERSTELLUNG
DES
IMMUNSTIMULIERENDEN
3
KD-FILTRATS
AUS
DER
ZELLFREIEN
HAEMOLYMPHE
VON
GALLERIA
MELLONELLA-LARVEN
31
3.4.7
SAEULENCHROMATOGRAPHIE
88
-
FPLC
(MITTELDRUCKCHROMATOGRAPHIE,
GELFILTRATION)
89
-
HPLC
(HOCHDRUCKCHROMATOGRAPHIE)
91
4.
ERGEBNISSE
93
4.1
EFFEKTE
PILZLICHER
PROTEASEN
AUF
DIE
ZELLULAERE
IMMUNABWEHR
VON
GALLERIA
MELLONELLA
93
4.1.1
ATTACHMENT
UND
SPREADING
VON
HAEMOCYTEN
AUS
MIT
PILZKONIDIEN
INFIZIERTEN
LARVEN
95
4.1.2
NACHWEIS
UND
CHARAKTERISIERUNG
PROTEOLYTISCHER
AKTIVITAET
IN
UNTERSCHIEDLICHEN
KULTURMEDIEN
97
4.1.2.1
VERGLEICH
DER
PROTEOLYTISCHEN
AKTIVITAET
BEI
KULTIVIERUNG
IN
CZAPEK-DOX
UND
CASEINMEDIUM
97
4.1.2.2
VERGLEICH
DER
PROTEOLYTISCHEN
AKTIVITAET
BEI
KULTIVIERUNG
IN
CUTICULA
UND
SABOURAUDMEDIUM
99
4.1.2.3
VERGLEICH
DER
PROTEOLYTISCHEN
AKTIVITAET
BEI
KULTIVIERUNG
IN
HAEMOLYMPH
UND
CASEINMEDIUM
101
4.1.2.4
CHARAKTERISIERUNG
DER
BEIDEN
FUER
DIE
WEITEREN
VERSUCHE
AUSGEWAEHLTEN
PILZSTAEMME
BEAUVERIA
BASSIANA
B.B.
A
UND
METARHIZIUM
ANISOPLIAE
M.A.
8
IN
BEZUG
AUF
DIE
VON
IHNEN
ENTWICKELTE
PROTEOLYTISCHE
AKTIVITAET
IN
PROTEINHALTIGEM
CASEINMEDIUM
103
4.1.3
WIRKUNG
PROTEASEHALTIGER
PILZKULTURMEDIEN
AUF
DAS
ATTACHMENT
ISOLIERTER
PLASMATOCYTEN
108
4.1.4
WIRKUNG
PROTEASEHALTIGER
PILZKULTURMEDIEN
AUF
DAS
SPREADING
ISOLIERTER
PLASMATOCYTEN
UND
GRANULAERER
ZELLEN
110
4.1.5
WIRKUNG
PROTEASEHALTIGER
PILZKULTURMEDIEN
AUF
DIE
PHAGOCYTOSE
ISOLIERTER
PLASMATOCYTEN
113
3
4.1.6
WIRKUNG
PROTEASEHALTIGER
PILZKULTURMEDIEN
AUF
DAS
CYTOSKELETT
ISOLIERTER
PLASMATOCYTEN
115
4.2
EFFEKTE
KAEUFLICHER
PROTEASEN
AUF
DIE
IMMUNABWEHR
VON
GALLERIA
MELLONELLA
118
4.2.1
WIRKUNG
KAEUFLICHER
PROTEASEN
AUF
DAS
ATTACHMENT
ISOLIERTER
PLASMATOCYTEN
119
4.2.2
WIRKUNG
KAEUFLICHER
PROTEASEN
AUF
DAS
SPREADING
ISOLIERTER
PLASMATOCYTEN
UND
GRANULAERER
ZELLEN
121
4.2.3
EINFLUSS
VON
PROTEASEN
AUF
DIE
GESAMTVITALITAET
VON
ZELLEN
-
MTT-TEST
124
4.2.4
WIRKUNG
KAEUFLICHER
PROTEASEN
AUF
DIE
PHAGOCYTOSE
ISOLIERTER
PLASMATOCYTEN
128
4.2.5
IMMUNISIERBARKEIT
VON
GALLERIA
MELLONELLA-LARVEN
GEGEN
PROTEASEN
130
4.2.6
AKTIVIERUNG
DER
HUMORALEN
IMMUNANTWORT
DURCH
PROTEASEN
132
4.2.7
GELELEKTROPHORETISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
HAEMOLYMPHPROTEINE
NACH
INJEKTION
VERSCHIEDENER
PROTEASEN
135
4.3
ERKENNUNG
UND
INAKTIVIERUNG
NICHT-REGULIERTER
PROTEASEAKTIVITAET
IN
DER
HAEMOLYMPHE
VON
GALLERIA
MELLONELLA
137
4.3.1
IMMUNAKTIVIERUNG
DURCH
INJEKTION
VON
MIT
THERMOLYSIN
VERDAUTER
HAEMOLYMPHE
139
4.3.2
GENAUERE
CHARAKTERISIERUNG
DER
IMMUNSTIMULIERENDEN
FRAKTION
AUS
DER
ZELLFTEIEN
HAEMOLYMPHE
VON
GALLERIA
MELLONELLA
142
4.3.3
VERGLEICH
UNTERSCHIEDLICHER
PROTEASEN
IN
IHRER
WIRKUNG
AUF
DIE
PROTEINE
IN
DER
ZELLFREIEN
HAEMOLYMPHE
VON
GALLERIA
MELLONELLA
144
4.3.4
GELELEKTROPHORETISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
ZELLFREIEN
HAEMOLYMPHE
VON
GALLERIA
MELLONELLA
NACH
INKUBATION
MIT
VERSCHIEDENEN
PROTEASEN
146
4.3.5
INKUBATION
VON
UNBEHANDELTER
UND
IMMUNISIERTER
HAEMOLYMPHE
MIT
THERMOLYSIN,
UND
ANSCHLIESSENDER
VERGLEICH
DERER
3
KD-FILTRATE
AUF
IHRE
IMMUNSTIMULIERENDE
WIRKUNG
149
4.3.6
IMMUNISIERBARKEIT
VON
GALLERIA
MELLONELLA-LARVEN
DURCH
INJEKTION
DES
IMMUNSTIMULIERENDEN
3
KD-FILTRATS
AUS
DER
ZELLFREIEN
HAEMOLYMPHE
153
4.3.7
NACHWEIS
DER
INDUKTION
VON
IMMUNPROTEINEN
IN
DER
HAEMOLYMPHE
VON
GALLERIA
MELLONELLA-LARVEN
DURCH
INJEKTION
DES
IMMUNSTIMULIERENDEN
3
KD-FILTRATS
155
4
INHALT
4.4
CHARAKTERISIERUNG
DER
IMMUNSTIMULIERENDEN
3
KD-FAKTOREN
AUS
DER
ZELLFREIEN
HAEMOLYMPHE
VON
GAUERIA
MELLONELLA
159
4.4.1
GELELEKTROPHORETISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
MOLEKUELE
IM
3
KD-FILTRAT
AUS
DER
MIT
THERMOLYSIN
INKUBIERTEN
ZELLFREIEN
HAEMOLYMPHE
VON
GALLERIA
MELLONELLA
161
4.4.2
INKUBATION
VON
NICHT-HAEMOLYMPH-PROTEINEN
MIT
THERMOLYSIN
UND
ANSCHLIESSENDE
UNTERSUCHUNG
DERER
3
KD-FILTRATE
AUF
IHRE
IMMUNSTIMULIERENDE
WIRKUNG
163
4.4.3
AUFTRENNUNG
DES
IMMUNSTIMULIERENDEN
3
KD-FILTRATS
AUS
DER
ZELLFREIEN
HAEMOLYMPHE
VON
GALLERIA
MELLONELLA-LARVEN
UEBER
SUPEROSE-12
(FPLC)
UND
ANSCHLIESSENDE
INJEKTION
GETRENNTER
FRAKTIONEN
166
4.4.4
AUFTRENNUNG
DES
IMMUNSTIMULIERENDEN
3
KD-FILTRATS
AUS
DER
ZELLFREIEN
HAEMOLYMPHE
VON
GALLERIA
MELLONELLA-LARVEN
MITTELS
HPLC
UND
ANSCHLIESSENDE
INJEKTION
DER
VERSCHIEDENEN
FRAKTIONEN
172
5.
DISKUSSION
182
5.1
EFFEKTE
PILZLICHER
PROTEASEN
AUF
DIE
ZELLULAERE
IMMUNABWEHR
VON
GALLERIA
MELLONELLA
182
5.2
EFFEKTE
KAEUFLICHER
PROTEASEN
AUF
DIE
IMMUNABWEHR
VON
GALLERIA
MELLONELLA
183
5.3
ERKENNUNG
UND
INAKTIVIERUNG
NICHT-REGULIERTER
PROTEASEAKTIVITAET
IN
DER
HAEMOLYMPHE
VON
GALLERIA
MELLONELLA
185
5.4
CHARAKTERISIERUNG
DER
IMMUNSTIMULIERENDEN
3
KD-FAKTOREN
AUS
DER
ZELLFREIEN
HAEMOLYMPHE
VON
GALLERIA
MELLONELLA
188
6.
ZUSAMMENFASSUNG
195
7.
LITERATUR
196
ANHANG
204
-
DANKSAGUNG
204
-
LEBENSLAUF
205
5 |
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