Klonierung und Expression von humanem L-Selektin: Charakterisierung der rekombinanten Proteinformen
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| Format: | Buch |
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1997
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
1
1.1
ZELLADHAESION
1
1.2
ZELLADHAESION
IM
IMMUNSYSTEM
1
1.3
ADHAESIONSMOLEKUELE
DER
ZELLULAEREN
IMMUNANTWORT
4
1.3.1
IMMUNGLOBULIN-SUPERFAMILIE
.
4
1.3.2
INTEGRINE
.
5
1.4
SELEKTINE
6
1.4.1
STRUKTUR
DER
SELEKTINE
.
7
1.4.2
EXPRESSION
VON
SELEKTINEN
.
9
1.4.3
LIGANDERKENNUNG
DURCH
SELEKTINE
.
10
1.4.4
LIGANDEN
DER
SELEKTINE
.
1
1
1.5
L-SELEKTIN
13
1.5.1
PHYSIOLOGISCHE
FUNKTION
VON
L-SELEKTIN
.
13
1.5.2
L-SELEKTIN
VERMITTELTE
ADHAESION
.
15
1.6
ZIELSETZUNG
18
2
ERGEBNISSE
20
2.1
KLONIERUNG
VON
L-SELEKTIN
AUS
EINER
CDNA
BANK
DER
HUMANEN
ZELLINIE
RAJI
2
0
2.2
L-SELEKTIN-KOENSTRUKTE
FUER
DIE
EXPRESSION
IN
PRO
UND
EUKARYONTEN
24
2.2.1
L-SELEKTIN
-
KONSTRUKTE
ZUR
EXPRESSION
IN
PRO
-
UND
EUKARYONTEN
.
24
2.2.2
ZELLULAERE
SYSTEME
ZUR
EXPRESSION
VON
L-SELEKTIN
.
25
2.2.3
ANWENDUNGSMOEGLICHKEITEN
DER
ZELLULAEREN
SYSTEME
UND
IHRER
EXPRESSIONSPRODUKTE.
.26
2.3
EXPRESSION
VON
REKOMBINANTEM
L-SELEKTIN
IN
PROKARYONTEN
28
2.3.1
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
VON
REKOMBINANTEM
L-SELEKTIN
MIT
HILFE
DES
GST
GENFUSION-SYSTEMS
.
28
2.3.2
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
VON
REKOMBINANTEM
L-SELEKTIN
ALS
THIOREDOXIN-FUSIONSPROTEIN
.
3
2
2.3.3
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
VON
REKOMBINANTEM
L-SELEKTIN
AUS
PERIPLASMAFRAKTIONEN
VON
E.COLI
.
35
2.4
EXPRESSION
VON
REKOMBINANTEM
HUMANEN
L-SELEKTIN
IN
EUKARYONTEN
39
2.4.1
EXPRESSION
VON
L-SELEKTIN
DURCH
EINSATZ
DES
EUKARYONTISCHEN
EXPRESSIONSVEKTORS
CR3.1
.
39
2.4.2
EXPRESSION
VON
L-SELEKTIN
DURCH
EINSATZ
DES
EUKARYONTISCHEN
EXPRESSIONSVEKTORS
PMPSV-HE
.
43
2.4.3
GEWINNUNG
VON
REKOMBINANTEM
L-SELEKTIN
AUS
DEN
ZELLINIEN
K562
UND
BHK
.
45
2.5
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
GLYKOSYLIERUNG
VON
L-SELEKTIN
AUS
EUKARYONTEN
46
2.5.1
CHARAKTERISIERUNG
DES
KOHLEHYDRATANTEILES
VON
L-SELEKTIN
.
46
2.5.2
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
LADUNGSHETEROGENITAET
VON
L-SELEKTIN
DURCH
IEF
.
50
2.6
EINSATZ
DER
REKOMBINANTEN
FORMEN
VON
L-SELEKTIN
IN
ADHAESIONSVERSUCHEN
52
2.6.1
KOMPETITION
L-SELEKTIN-ABHAENGIGER
ADHAESION
DURCH
REKOMBINANTES
HUMANES
L-SELEKTIN
IN
DER
FLUSSKAMMER
.
52
2.6.2
L-SELEKTIN
ABHAENGIGE
TRANSMIGRATION
DURCH
RATTEN
HEC
(HIGH
ENDOTHELIAL
CELLS)
.
56
3
DISKUSSION
59
3.1
DIE
SEQUENZ
VON
HUMANEM
L-SELEKTIN
59
3.1.1
POTENTIELLE
JV-GLYKOSYLIERUNGSSTELLEN
IN
DER
L-SELEKTIN
SEQUENZ
.
60
3.1.2
DOMAENENSPEZIFISCHE
VERTEILUNG
DER
GLYKOSYLIERUNGSSTELLEN.
.
62
3.2
EXPRESSION
VON
REKOMBINANTEM
L-SELEKTIN
63
3.2.1
PROTEINFALTUNG
.
63
3.2.2
PHYSIKALISCHE
UND
PHYSIOLOGISCHE
STABILITAET
.
.65
3.3
CHARAKTERISIERUNG
VON
REKOMBINANTEM
L-SELEKTIN
66
3.3.1
GLYKOSYLIERUNG
VON
REKOMBINANTEM
L-SELEKTIN
.
66
3.3.2
GRANULOZYTAERE
GLYKOSYLIERUNG
VON
L-SELEKTIN
.
67
3.4
NAEHWEIS
DER
BIOLOGISCHEN
AKTIVITAET
68
3.4.1
TESTSYSTEME
FUER
L-SELEKTIN
VERMITTELTE
ZELLADHAESION.
.
68
3.4.2
EINSATZ
VON
REKOMBINANTEM
L-SELEKTIN
IN
ZELLBINDUNGSSTUDIEN.
.
71
3.5
AUSBLICK
14
4
ZUSAMMENFASSUNG
77
5
MATERIAL
UND
METHODEN
79
5.1
MATERIAL
79
5.1.1
VEKTOREN
.
79
5.1.2
BAKTENENSTAEMME
.
79
5.1.3
ZELLINIEN
.
80
5.1.4
PRIMAERKULTUREN
.
8
0
5.1.5
ANTIKOERPER
.
80
5.1.6
REAKTIONSKITS
.
81
5.1.7
ENZYME
.
81
5.1.8
NUKLEOTIDE
UND
PRIMER
.
82
5.1.9
GROEBENGEWICHTSSTANDARDS
FUER
DNA
UND
PROTEINE
.
83
5.1.10
PUFFERLOESUNGEN
.
83
5.1.11
SUBSTANZEN
.
83
5.1.12
VERBRAUCHSMATERIALIEN
.
85
5.1.13
GERAETE
.
86
S.2
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
87
5.2.1
AUFARBEITUNG
VON
DNA
AUS
BLUTZELLEN
FILR
EINE
PCR
(POLYMERASE
CHAIN
REACTION)
.
87
5.2.2
PRAEPARATION
VON
DNA
AUS
BAKTERIOPHAGEN
.
87
5.2.3
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
.
88
5.2.4
REINIGUNG
VON
DNA
DURCH
PHENOLEXTRAKTION
UND
ETHANOLPRAEZIPITATION
.
89
5.2.5
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
DNA
.
89
5.2.6
RESTRIKTION
VON
DNA
.
89
5.2.7
ELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
DNA
.
90
5.2.8
REINIGUNG
UND
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
90
5.2.9
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
RESTRINGIERTER
DNA
.
91
5.2.10
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
91
5.2.11
TRANSFORMATION
VON
PLASMID-DNA
IN
E.COLI
.
91
5.2.12
ERSTELLEN
KOMPETENTER
ZELLEN
FUR
DIE
TRANSFORMATION
.
92
5.2.13
GEFRIERKULTUREN
VON
E.COLI
.
93
5.2.14
PCR
AMPLIFIKATION
.
93
5.2.15
KLONIERUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
.
96
5.2.16
DIG-MARKIERUNG
EINER
DNA-SONDE
DURCH
NICK-TRANSLATION
.
96
5.2.17
SCREENENEINER
XGTLO
PHAGEN
CDNA
BANK
.
97
5.2.18
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
NACH
SANGER
.
99
5.3
PROTEINCHEMISCHE
UND
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
100
5.3.1
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
PROTEINEN
.
100
5.3.2
ENTSALZEN
UND
KONZENTRIEREN
VON
PROTEINLOESUNGEN
.
100
5.3.3
ERSTELLEN
VON
ZELLLYSATEN
DURCH
SOLUBILISIERUNG
.
101
5.3.4
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
101
5.3.5
ISOELEKTISCHE
FOKUSSIERUNG
(IEF)
VON
PROTEINEN
MIT
AMPHOLINEN
.102
5.3.6
NACHWEIS
VON
PROTEINEN
IN
SDS-GELEN
.
103
5.3.7
PROTEINTRANSFER
AUF
NITROZELLULOSEMEMBRANEN
(WESTERN-BLOT)
.
104
5.3.8
NACHWEIS
VON
PROTEINEN
AUF
NITROZELLULOSE
.
104
5.3.9
NACHWEIS
VON
KOHLEHYDRATSTRUKTUREN
DURCH
LEKTINE
.105
5.3.10
REINIGUNG
MONOKLONALER
ANTIKOERPER
AUS
ZELLKULTURUEBERSTAENDEN
.
106
5.3.11
BIOTINYLIERUNG
MONOKLONALER
ANTIKOERPER
.
107
5.3.12
ERSTELLEN
EINER
AFFINITAETSSAEULE
ZUR
REINIGUNG
VON
L-SELEKTIN
.
107
5.3.13
REINIGUNG
VON
SL-SELEKTIN
AUS
ZELLKULTURUEBERSTAENDEN
.
108
5.3.14
NACHWEIS
UND
KONZENTRATIONSBESTINUNUNG
VON
L-SELEKTIN
DURCH
ELISA
.
109
5.3.15
VERDAU
VON
L-SELEKTIN
MIT
GLYKOSIDASEN
.
110
5.3.16
INDUKTION
POLYKLONALER
ANTIKOERPER
IN
KANINCHEN
.
110
5.3.17
AUFBEREITUNG
POLYKLONALER
ANTIKOERPERSEREN
AUS
KANINCHEN
.
111
5.4
METHODEN
ZUR
PROKARYONTISCHEN
PROTEINEXPRESSION
112
5.4.1
EXPRESSIONSSYSTEME
.
112
5.4.2
INDUKTION
DER
PROTEINEXPRESSION
DURCH
IPTG
.
112
5.4.3
OPTIMIERUNG
DER
PROTEINEXPRESSION
.113
5.4.4
AUFSCHLUSS
VON
BAKTERIEN
DURCH
ULTRASCHALLBEHANDLUNG
.113
5.4.5
REINIGUNG
VON
EINSCHLUSSKOERPERCHEN
DURCH
DETERGENTIEN
.
114
5.4.6
AUFSCHLUSS
VON
EINSCHLUSSKOERPERCHEN
.
114
5.4.7
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHISCHE
REINIGUNG
DER
FUSIONSPROTEINE
.115
5.4.8
PRAEPARATION
VON
PERIPLASMAFRAKTIONEN
AUS
E.COLI
.
116
5.4.9
PROTEOLYTISCHE
SPALTUNG
VON
FUSIONSPROTEINEN
DURCH
THROMBIN
.
116
5.4.10
DIALYSE
VON
PROTEINLOESUNGEN
.
;
.
116
5.5
ZELLBIOLOGISCHE
METHODEN
117
5.5.1
ISOLIERUNG
VON
LYMPHOZYTEN
AUS
HUMANEM
BLUT
.
117
5.5.2
ZELLKULTUR
VON
HUMANEN
LYMPHOZYTEN
.
118
5.5.3
ZELLKULTUR
HUMANER
LYMPHOM-ZELLINIEN
.118
5.5.4
ZELLKULTUR
VON
BHK-ZELLEN
.
118
5.5.5
ANLEGEN
VON
GEFRIERKULTUREN
.
119
5.5.6
TRANSFEKTION
VON
ZELLINIEN
.
119
5.5.7
SELEKTION
TRANSFIZIERTER
ZELLEN
DURCH
ANTIBIOTIKA
.
.
121
5.5.8
ANREICHERUNG
TRANSFIZIERTER
ZELLEN
DURCH
MAGNETPARTIKEL
.
121
5.5.9
KLONIERUNG
VON
TRANSFIZIERTEN
ZELLEN
.
122
5.5.10
AKTIVIERUNG
VON
TRANSFIZIERTEN
K562-ZELLEN
.123
5.5.11
DMM-BEHANDLUNG
VON
BHK-ZELLEN
.
123
5.5.12
FACS
(FLUORESCENCE
ACTIVATED
CELL
SCAN)
-ANALYSEN
.
123
6
LITERATURVERZEICHNIS
125 |
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| spelling | Fieger, Claudia 1965- Verfasser (DE-588)120668106 aut Klonierung und Expression von humanem L-Selektin Charakterisierung der rekombinanten Proteinformen Claudia Fieger 1997 137 S. Ill., graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Berlin, Freie Univ., Diss., 1998 Selectine (DE-588)4472944-3 gnd rswk-swf Rekombinantes Protein (DE-588)4277353-2 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Selectine (DE-588)4472944-3 s Rekombinantes Protein (DE-588)4277353-2 s DE-604 DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=008353847&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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