Verfügbarkeit: Konditionale Cre-, loxP-katalysierte Genveränderungen in der Maus zur Aufklärung der Rolle des Zytokinrezeptors gp130 in vivo

Konditionale Cre-, loxP-katalysierte Genveränderungen in der Maus zur Aufklärung der Rolle des Zytokinrezeptors gp130 in vivo:

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser:	Betz, Ulrich A. K. 1967- (VerfasserIn)
Format:	Abschlussarbeit Buch
Sprache:	German
Veröffentlicht:	1998
Schlagworte:	Maus Struktur-Aktivitäts-Beziehung Rezeptor Cytokine Genmutation Hochschulschrift
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Beschreibung:	XI, 257 S. Ill., graph. Darst.

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adam_text	INHALTSVERZEICHNIS A. EINLEITUNG 001 A.L METHODIK: DIE GEZIELTE GENINAKTIVIERUNG IN DER MAUS 001 A.1.1 DIE KONVENTIONELLE METHODE 001 A.1.2 DIE KONDITIONALE METHODE 002 A.2 DIE BIOLOGISCHEN FRAGESTELLUNGEN 005 A.2.1 DIE ANALYSIERTEN GENE UND PROTEINE 005 A.2.1.1 ZYTOKINE 005 A.2.1.1.1 DER ZYTOKINREZEPTOR GPL30 007 A.2.1.1.2 DER ZYTOKINREZEPTOR IL-2RY 018 A.2.1 .2 DAS INTERMEDIAERFILAMENT NESTIN 019 A.2.1.3 DAS REPARATURENZYM DNA-POLYMERASE SS (POLSS) 020 A.2.2 DIE ANALYSIERTEN SYSTEME UND PROZESSE 020 A.2.2.1 DIE HAEMATOPOESE 020 A.2.2.2 DAS IMMUNSYSTEM 023 A.2.2.3 DIE AKUTE-PHASE-ANTWORT 028 A.3 ZIELSETZUNG DER ARBEIT 029 B. MATERIAL UND METHODEN 031 B.L MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 031 B.1.1 AGAROSEGELELEKTROPHORESE 031 B.1.2 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA 031 B.L. 3 ISOLIERUNG GENOMISCHER DNA 031 B.L.3.1 ISOLIERUNG GENOMISCHER DNA AUS ZELLINIEN 031 B.L.3.2 ISOLIERUNG GENOMISCHER DNA AUS ORGANEN 032 B.L. 3.3 ISOLIERUNG GENOMISCHER DNA AUS 032 MAEUSESCHWANZBIOPSIEN B.1.4 ISOLIERUNG VON RNA 032 B.L .5 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN 033 B.1.6 KONSTRUKTION REKOMBINANTER PLASMIDE 033 B.L. 7 DNA-SEQUENZIERUNG 034 B.L. 8 POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR) 034 B.1.9 SYNTHETISCHE OLIGONUKLEOTIDE 036 B.L .10 TRANSFEKTION VON BAKTERIEN 037 B.L. 11 SOUTHERN BLOT 037 B.1.12 QUANTIFIZIERUNG CRE-VERMITTELTER REKOMBINATION 038 B.1.13 PRAEPARATION DER DNA ZUR PRONUKLEUSMIKROINJEKTION038 N _ ICHAII B.2 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 039 B.2.1 TRYPSINISIERUNG VON ZELLEN 039 B.2.2 EINFRIEREN VON ZELLEN 039 B.2.3 PRAEPARATION VON EMBRYONALEN FEEDER-ZELLEN 040 (EF-ZELLEN) B.2.4 GEWINNUNG LIF-HALTIGEN UEBERSTANDES 040 B.2.5 KULTUR VON EMBRYONALEN STAMMZELLEN (ES-ZELLEN) 041 B.2.6 TRANSFEKTION VON ES-ZELLEN 042 B.2.7 SELEKTION REKOMBINANTER ES-ZELLEN 042 B.2.8 ISOLIERUNG VON ES-ZELLKOLONIEN 043 B.2.9 PRAEPARATION VON ZELLSUSPENSIONEN AUS 043 MAEUSEORGANEN B.2.10 IMMUNFLUORESZENZ UND DURCHFLUSSZYTOMETRIE 044 (FACS) B.2.11 MAGNETISCHE ZELLSORTIERUNG (MACS) 045 B.2.12 DETEKTION VON SS-GALAKTOSIDASE 046 B.2.13 PROLIFERATIONSTEST 046 B.2.14 BLUTBILDBESTIMMUNG 047 B.2.15 BESTIMMUNG DER ANZAHL HAEMATOPOETISCHER 047 VORLAEUFER (GM-CFU) B.3 TIEREXPERIMENTELLE METHODEN 048 B.3.1 MAEUSE 048 B.3.2 ANTIBIOTIKAGABE 048 B.3.3 NARKOSE 048 B.3.4 SUPEROVULATION 049 B.3.5 BLASTOZYSTENINJEKTION 049 B.3.6 MORULAEAGGREGATION 050 B.3.7 PRONUKLEUSMIKROINJEKTION 051 B.3.8 IMMUNISIERUNG 052 B.3.9 BESTIMMUNG DES BLUTZUCKERSPIEGELS 052 B.3.10 BLUTENTNAHME 052 B.3.11 BESTIMMUNG DER ANZAHL HAEMATOPOETISCHER 053 VORLAEUFER (CFU-S) B.4 SEROLOGISCHE METHODEN 053 B.4.1 ELISA (ENZYME LINKED INUNUNOSORBENT ASSAY) 053 INHALT _ FFI C. ERGEBNISSE 056 C.L ETABLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG NESTIN-CRE 056 TRANSGENER MAUSLINIEN C.1.1 KONSTRUKTION DER EXPRESSIONSVEKTOREN 057 C.L. 1.1 KONSTRUKTION VON PNESI2CREC-L 057 C.L.1.2 KONSTRUKTION VON PSLNE4C 059 C.L. 2 TEST AUF FUNKTIONALITAET DER GENERIERTEN KONSTRUKTE 060 C.L. 3 GENERIERUNG TRANSGENER GRUENDERTIERE 061 C.L. 4 ANALYSE DER TRANSGENEN GRUENDERTIERE 061 C.L. 5 GENERIERUNG TRANSGENER MAUSSTAEMME 062 C.L. 6 CHARAKTERISIERUNG CRE-VERMITTELTER REKOMBINATION 063 IN NESTIN-CRE TRANSGENEN MAEUSEN C.L. 6.1 CRE-LOXP-VERMITTELTE DELETION IST IN ALLEN 063 ORGANEN DETEKTIERBAR C.L.6.2 NESTIN-CRE TRANSGENE MAEUSE DELETIEREN 066 LOXP-FLANKIERTE ZIELSEQUENZEN IN DER KEIMBAHN C.L. 6.3 INSTABILITAET DES TRANSGENEN LOCUS 067 C.L.6.4 ANALYSE DER EXPRESSION VON CRE-REKOMBINASE 069 WAEHREND DER ONTOGENESE C.L.6.5 UNTERSUCHUNGEN ZUR KLAERUNG DER ENTSTEHUNG DER 069 MOSAIKSITUATION IN NESTIN-CRE TRANSGENEN TIEREN C.L .6.6 EINSATZMOEGLICHKEIT NESTIN-CRE TRANSGENER 071 MAUSLINIEN C.1.7 GENERIERUNG UND ANALYSE IL-2RY-DEFIZIENTER 071 MOSAIKMAEUSE C.L .8 GENERIERUNG UND ANALYSE POLSS-DEFIZIENTER 075 MOSAIKMAEUSE C.L.8.1 UEBERWINDUNG DER LETALITAET DER POLSS-DEFIZIENZ 075 MIT MOSAIKINDIVIDUEN C.L .8.2 POLSS-DEFIZIENTE KEIMBAHNZELLEN SIND FUNKTIONELL 077 C.L.8.3 DER ANTEIL VON POLSSA/A ZELLEN IN BAL2;POLSSFL X /A 080 MAEUSEN SINKT IM LAUFE DER EMBRYONALENTWICKLUNG C.L. 9 ZUSAMMENFASSUNG 080 INHALT IY _ C.2 DIE EXPRESSION VON GPL30 UND IL-6RA IN T-ZELLEN 081 C.2.1 DIE EXPRESSION VON GPL30 UND IL-6RA WAEHREND 081 DER T-ZELL-ENTWICKLUNG IM THYMUS C.2.2 CHARAKTERISIERUNG IL-6ROR UND IL-6RA + 084 CD4SP THYMOZYTEN C.2.2 .1 IL-6RORCD4SP THYMOZYTEN SIND CORTISON 084 SENSITIV C.2.2.2 IL-6RA+ CD4SP THYMOZYTEN TRETEN ERST NACH 084 DER GEBURT AUF C.2.2.3 IL-6RCR CD4SP THYMOZYTEN ZEIGEN EINEN 086 UNREIFEN PHAENOTYP C.2.2.4 TCR-KREUZVEMETZUNG INDUZIERT PROLIFERATION 088 VON IL-6RA+ ABER NICHT VON IL-6ROR CD4SP THYMOZYTEN C.2.3 KINETIK DER LIGAND-VERMITTELTEN 089 INTERNALISIERUNG UND REEXPRESSION VON GPL30 UND IL-6RA IN CD4+ UND CD8+ T ZELLEN C.2.3.1 STUDIEN ZUR GPL30/IL-6RA INTERNALISIERUNG UND 089 REEXPRESSIONIN VITRO C.2.3.2 STUDIEN ZUR GPL30/IL-6RA INTERNALISIERUNG 094 UND REEXPRESSIONIN VIVO C.2.4 GPL30/IL-6RA EXPRESSION NACH ANTIGENERFAHRUNG 096 C.2.4.1 DIE ZELLOBERFLAECHENEXPRESSION VON GPL30 UND 096 IL-6RA AUF T-ZELLEN NIMMT NACH ANTIGENER STIMULATION IN VITRO AB C.2.4.2 DIE ZELLOBERFLAECHENEXPRESSION VON GPL30 UND 096 IL-6RA AUF T-ZELLEN NIMMT NACH ANTIGENER STIMULATION IN VIVO AB C.2.4.3 GPL30L W /' T ZELLEN ZEIGEN EINEN FUER 099 GEDAECHTNISZELLEN TYPISCHEN PHAENOTYP INHALT Y C.3 HERSTELLUNG UND ANALYSE KONDITIONAL GPL30 101 DEFIZIENTER MAEUSE C.3.1 KONSTRUKTION EINES VEKTORS ZUR KONDITIONALEN 101 INAKTIVIERUNG DES FUER GPL30 KODIERENDEN GENS DER MAUS C.3.2 ETABLIERUNG EINER PCR ZUR IDENTIFIZIERUNG 104 HOMOLOGREKOMBINANTER ES-ZELLKLONE C.3.3 GENERIERUNG HOMOLOG REKOMBINANTER 104 ES-ZELLKLONE C.3.4 DELETION DES LOXP-FLANKIERTEN 108 NEOMYZINRESISTENZGENS C.3.5 GENERIERUNG CHIMAERER TIERE UND TRANSMISSION 111 DES GPL30FL X ALLELS IN DIE KEIMBAHN C.3.6 CHARAKTERISIERUNG DES GPL30FL X ALLELS 113 C.3.7 KONDITIONALE INAKTIVIERUNG DES GPL30-GENS 113 C.3.7.1 BALANCER2: GENERIERUNG UND ANALYSE 116 GPL30-MUTANTER MOSAIKTIERE C.3.7.2 MXCRE 119 C.3.7. 3 ICKCRE 124 C.3.7 .4 CD19CRE 124 C.3.7.5 LYSMCRE 125 C.3.8 NACHWEIS DER FUNKTIONELLEN INAKTIVIERUNG VON 126 GPL30 C.3.8.1 GPL30^A INDIVIDUEN SIND NICHT LEBENSFAEHIG 126 C.3.8.2 NACH INDUKTION IST KEIN GPL30 MEHR AUF DER 127 OBERFLAECHE VON PERIPHEREN T-ZELLEN NACHZUWEISEN C.3.8.3 DIE KONZENTRATION VON SGPL30 IST IM BLUT 127 VON GPL3QA/+ TIEREN STARK ERHOEHT C.3.8.4 GPL30* THYMOZYTEN SIND DURCH IL-6 NICHT 127 MITOTISCH STIMULIERBAR C.3.8.5 IN DER ABWESENHEIT VON MEMBRANSTAENDIGEM 129 GPL30 ERFOLGT KEINE IL-6-INDUZIERTE HERUNTERREGULATION VON IL-6RA MEHR C.3.9 CHARAKTERISIERUNG KONDITIONAL GPL30 129 MUTANTER TIERE C.3.9.1 MXCRE;GPL30FL X /A X TIERE ZEIGEN EINE 131 ERHOEHTE LETALITAET UND SIND IM GEWICHT REDUZIERT C.3.9.2 ANALYSE DER HAEMATOPOESE IN DER ABWESENHEIT 131 VON GPL30 C.3.9.2.1 ANALYSE DER BASALBLUTWERTE 131 C.3.9.2.2 ANALYSE HAEMATOPOETISCHER KAPAZITAET NACH 133 5-FU APPLIKATION C.3.9.2.3 DEFEKTE THROMBOZYTENRESYNTHESE IN 135 MXCRE;GPL30FL X / " OX TIEREN C.3.9.2.4 DIE ANZAHL VON HAEMATOPOETISCHEN 135 VORLAEUFERZELLEN IST IN MXCRE;GPL30FL X /A X TIEREN NUR LEICHT VERRINGERT C.3.9.2.5 GPL30 SPIELT IN DER T-ZELL-, NICHT ABER DER 137 B- ZELLENTWICKLUNG EINE ROLLE C.3.9.3 ANALYSE DER IMMUNITAET IN KONDITIONAL 139 GPL30-MUTANTEN TIEREN C.3.9.3.1 GPL30-MUTANTE UND WILDTYP T-ZELLEN IM 139 KOMPETITIVEN VERGLEICH C.3.9.3.2 MXCRE;GPL30FL X /FLOX TIERE ZEIGEN KEINEN 143 GENERELLEN DEFEKT IN DER SYNTHESE VON ANTIKOERPERN ABER EINE GESTEIGERTE TENDENZ ZU TH2-IMMUNANTWORTEN C.3.9.3.3 DIE TENDENZ ZU T H 2 ANTWORTEN IST 145 TEILWEISE DURCH DAS FEHLEN VON GPL30-SIGNALEN BEI T-ZELLEN ZU ERKLAEREN C.3.9.3.4 DIE PRODUKTION ANTIGENSPEZIFISCHER 145 ANTIKOERPER DER IGG-KLASSEN IST IN DEN MXCRE;GPL30FL X /^ OX TIEREN NICHT STAERKER BEEINTRAECHTIGT ALS IN IL-6-DEFIZIENTEN MAEUSEN C.3.9 .3.5 MXCRE;GPL30FL X /FLOX TIERE ZEIGEN IM 149 GLEICHEN AUSMASS WIE IL-6-DEFIZIENTE TIERE EINE GESTEIGERTE SUSZEPTIBILITAET FUER INFEKTIONEN MIT BAKTERIELLEN UND VIRALEN PATHOGENEN INHALT _ YB C.3.9.4 DIE LEBER 150 C.3.9.4.1 DRASTISCHE HISTOLOGISCHE VERAENDERUNGEN 150 IN DER GPL30-MUTANTEN LEBER C.3.9.4.2 DIE SYNTHESE AKUTER-PHASE-PROTEINE IN DER 154 KONDITIONAL GPL30-MUTANTEN LEBER NACH LPS-INJEKTION IST DEFEKT C.3.9.5 MXCRE;GPL30FL X /H X TIERE ENTWICKELN MIT 156 ZUNEHMENDEM ALTER EIN LUNGENEMPHYSEM C.3.9.6 IN MXCRE;GPL30FL X /A X TIEREN IST DIE 156 HERZWANDDICKE SOWIE DER CARDIOMYOZYTENDURCHMESSER VERRINGERT C.3.9.7 DAS FEHLEN VON GPL30-SIGNALEN FUEHRT ZUR 158 DEGENERATION MYELINISIERTER UND NICHTMYELINISIERTER PERIPHERER NERVEN BEGINNEND AN DEN SCHWANNSCHEN ZELLEN D. DISKUSSION 161 D.L NESTIN-CRE TRANSGENE TIERE 161 D.1.1 DIE FEHLENDE GEWEBSSPEZIFITAET IN NESTIN-CRE 161 TRANSGENEN MAEUSEN D.1.2 MITTELS CRE/LOXP-KATALYSIERTER REKOMBINATION 162 GENERIERTE MOSAIKMAEUSE IM VERGLEICH ZU CHIMAEREN TIEREN, DIE MIT HOMOZYGOT MUTANTEN ES-ZELLEN HERGESTELLT WURDEN D.1.3 ANWENDUNGSMOEGLICHKEITEN FUER BALANCER MAEUSE 163 D.L. 4 AUS DEN BALANCER MAEUSEN KOENNEN EINIGE FUER DAS 165 GEBIET DER KONDITIONALEN GENINAKTIVIERUNG GENERELL BEDEUTSAME SCHLUESSE GEZOGEN WERDEN D.2 DNA POLYMERASE SS 166 D.2.1 POL SS-DEFIZIENTE ZELLEN BESITZEN GEGENUEBER 166 WILDTYPZELLEN WAEHREND DER EMBRYONAL ENTWICKLUNG EINEN KOMPETITIVEN NACHTEIL YID _ INHALT D.3 DIE EXPRESSION VON GPL30 UND IL-6RA AUF T-ZELLEN 168 D.3.1 IL-6RA ALS REIFUNGSMARKER FUER CD4SP THYMOZYTEN 168 D.3.2 VERHAELTNIS DER GPL30/IL-6RA EXPRESSION IN CD4 170 UND CD8 T-ZELLEN D.3.3 RESYNTHESE VON GPL30 UND IL-6RA 171 D.3.4 T-ZELL-AKTIVIERUNG UND GPL30/IL-6RA EXPRESSION 172 D.4 KONDITIONAL GPL30-MUTANTE TIERE 173 D.4.1 DIE TODESURSACHE IN GPL30-DEFIZIENTEN MAEUSEN 173 D.4.2 ANWENDBARKEIT VERSCHIEDENER CRE-TRANSGENER 174 STAEMME D.4.3 GPL30 WIRD DURCH DIE EINGEFUEHRTE MUTATION 175 INAKTIVIERT D.4.4 EINE 20-FACH ERHOEHTE KONZENTRATION VON SGPL30 176 BLEIBT OHNE GROESSERE AUSWIRKUNGEN D.4.5 TODESURSACHE IN MXCRE;GPL30FL X/A X TIEREN 177 D.4.6 UNTERREPRAESENTATION GPL30-MUTANTER ZELLEN IN 179 MOSAIKTIEREN D.4.7 HAEMATOPOESE OHNE GPL30-SIGNALE 180 D.4.8 GEGENUEBER IL-6 SPIELEN ANDERE MITGLIEDER DER 182 GPL30-ABHAENGIGEN ZYTOKINFAMILIE IM IMMUNSYSTEM EINE UNTERGEORDNETE ROLLE D.4.9 IMMUNGLOBULINPRODUKTION 183 D.4.10 EFFEKTE VON GPL30-SIGNALEN AUF T-ZELLEN 184 D.4.11 ERHOEHTE SUSZEPTIBILITAET DER MXCRE;GPL30FL X /A X 186 TIERE FUER INFEKTIONEN - WARUM? D.4.12 MORPHOLOGISCH ABNORMALE HEPATOZYTEN, EINE 187 DEFEKTE AKUTE-PHASE-ANTWORT UND EMPHYSEM ENTSTEHUNG - EINE WIRKUNGSKETTE? D.4.13 DAS HERZ IN MXCRE;GPL30FL X /A X MAEUSEN 189 D.4.14 DEGENERATION VON SCHWANNSCHEN ZELLEN OHNE 190 GPL30-SIGNALE D.4.15 ALLGEMEINE BEMERKUNGEN ZU KONVENTIONELLEN 191 KNOCK-OUT MAEUSEN IM GPL30-SYSTEM D.4.16 ALLGEMEINE BEMERKUNGEN ZU KONDITIONAL 193 GPL30-MUTANTEN TIEREN INHALT IX E. UEBERSICHT 193 F. AUSBLICK 194 F.L DNA POLYMERASE SS 194 F.2 GPL30/IL-6RA-EXPRESSIONSANALYSEN 195 F.3 FUNKTION VON SGPL30 195 F.4 KONDITIONAL GPL30-MUTANTE MAEUSE 196 G. ZUSAMMENFASSUNG 198 H. LITERATUR 200 I. ANHANG: DIE NUMEROLOGIE DER KONDITIONALEN 239 GENINAKTIVIERUNG LI HERLEITUNG VON GLEICHUNGEN ZUR BESTIMMUNG DES 240 DELETIONSINDEX (X) BEI VERSCHIEDENEN GENOTYPEN UND SOUTHERNSTRATEGIEN 1.2 DAS PROBLEM DES HINTERGRUNDS 246 1.3 TOD ODER UEBERLEBEN: DER EINFLUSS DER SELEKTION AUF DIE 248 CRE / LOXP-TECHNOLOGIE K. VERSICHERUNG 253 L. ANMERKUNGEN 254 M. DANKSAGUNG 256 N. 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