Entwicklung von molekularbiologischen Methoden zum spezifischen Nachweis von Shiga-Toxin-bildenden und enterotoxischen Escherichia coli in Futtermitteln:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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1998
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1.
EINLEITUNG
.
1
2.
SCHRIFTTUM
.
2
2.1.
MIKROORGANISMEN
IN
FUTTERMITTELN
.
2
2.1.1.
DER
NATUERLICHE
KEIMBESATZ
FRISCHER
FUTTERMITTEL
.
2
2.1.2.
DER
KEIMBESATZ
WAEHREND
DES
MIKROBIELLEN
VERDERBS
.
4
2.2.
MIKROBIELLE
TOXINE
IN
FUTTERMITTELN
.
8
2.3.
MASSNAHMEN
ZUR
QUALITAETSSICHERUNG
VON
FUTTERMITTELN
.
10
2.3.1.
DIE
GESETZLICHEN
GRUNDLAGEN
DER
FUTTERMITTELUNTERSUCHUNG
.
10
3.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
25
3.1.
VERWENDETE
BAKTERIENSTAEMME
.
25
3.2.
FUTTERMITTELPROBEN
.
27
3.3.
KULTURELL-BAKTERIOLOGISCHE
UNTERSUCHUNG
DER
FUTTERMITTELPROBEN
.
29
3.4.
ISOLIERUNG
VON
E.
CO/F-KEIMEN
AUS
FUTTERMITTELN
.
29
3.5.
PHAENOTYPISCHE
CHARAKTERISIERUNG
VON
BAKTERIENISOLATEN
.
29
3.5.1.
BIOCHEMISCHE
DIFFERENZIERUNG
.
29
3.5.2.
SEROLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
E.
COLI-ISOLATE
.
30
3.5.3.
RESISTENZTEST
GEGEN
CHEMOTHERAPEUTISCHE
WIRKSTOFFE
.
30
3.5.4.
NACHWEIS
VON
HAEMOLYSINEN
.
31
3.5.5.
NACHWEIS
VON
SHIGA-TOXINEN
UND
HITZESTABILEM
ENTEROTOXIN
.
31
3.6.
POLYMERASE-KETTENREAKTIONEN
(PCR)
.
32
3.6.1
DNS-SYNTHESE
UND
REINIGUNG
DER
PRIMER
FUER
DIE
PCR
.
32
3.6.2.
EINZELPRIMER-PCR
.
32
3.6.3.
MULTIPRIMER-PCR
(MPPCR)
.
36
3.7.
ANALYSE
VON
PCR-PRODUKTEN
DURCH
RESTRIKTION
.
40
3.8.
ANALYSE
VON
PCR-PRODUKTEN
DURCH
SEQUENZIERUNG
.
41
3.9.
AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE
VON
DNS
.
41
3.10.
ISOLIERUNG
VON
DNS
AUS
AGAROSEGELEN
.
42
3.11.
ISOLIERUNG
VON
DNS
AUS
BAKTERIENKULTUREN
.
42
3.11.1.
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNS
.
42
3.11.2.
PRAEPARATION
GENOMISCHER
DNS
.
42
3.12.
HYBRIDISIERUNGSVERFAHREN
.
43
3.12.1.
MARKIERUNG
VON
GENSONDEN
.
43
3.12.2.
DNS-BLOT-VERFAHREN
.
44
3.12.3.
HYBRIDISIERUNGSBEDINGUNGEN
.
45
4.
ERGEBNISSE
.
46
4.1.
KULTURELL-BAKTERIOLOGISCHE
UNTERSUCHUNG
DER
FUTTERMITTELPROBEN
.
46
4.2.
NACHWEIS
VON
TOXINOGENEN
E.
COLI
MITTELS
MULTIPRIMER
POLYMERASEKETTENREAKTION
(MPPCR)
.
46
4.2.1.
NACHWEIS
AUS
KUENSTLICH
KONTAMINIERTEN
FUTTERMITTELN
.
46
4.2.2.
NACHWEISGRENZE
DER
MPPCR
FUER
DEN
NACHWEIS
TOXLNOGENER
E.
COLI
IN
FUTTERMITTELN
.
48
4.2.3.
SPEZIFITAET
UND
SENSITIVITAET
DER
MULTIPRIMER-PCR
.
49
4.2.4.
NACHWEIS
AUS
FUTTERMITTELANREICHERUNGEN
.
51
4.3.
NACHWEIS
DER
GENE
FUER
STX1
,
STX2,
ST-IA,
ST-IB
UND
LT-I
IN
DEN
FUTTERMITTELISOLATEN
.
54
4.3.1.
EPPCR
UND
RESTRIKTIONSANALYSE
(STX1
,
STX2,
ST-LB,
IT-I)
BZW.
SEQUENZIERUNG
(ST-LA)
.
55
4.3.2.
UNTERSUCHUNG
DER
FUTTERMITTELISOLATE
MITTELS
KOLONIENBLOT-HYBRIDISIERUNG
(KBH)
.
60
4.3.3.
CHARAKTERISIERUNG
DER
TOXINOGENEN
FUTTERMITTELISOLATE
MITTELS
PLASMIDANALYSE
.
71
4.4.
PHAENOTYPISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
TOXINOGENEN
FUTTERMITTELISOLATE
.
73
4.4.1.
BIOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
UND
SPEZIES-BESTIMMUNG
DER
FUTTERMITTELISOLATE
.
73
4.4.2.
PHAENOTYPISCHER
NACHWEIS
DER
TOXINBILDUNG
DER
TOXINOGENEN
FUTTERMITTELISOLATE
.
74
4.4.3.
CHARAKTERISIERUNG
DER
OBERFLAECHENANTIGENE
DER
FUTTERMITTELISOLATE
.
75
4.4.4.
RESISTENZSPEKTRUM
DER
FUTTERMITTELISOLATE
GEGEN
CHEMOTHERAPEUTISCHE
WIRKSTOFFE
.
75
5.
DISKUSSION
.
77
6.
ZUSAMMENFASSUNG
.
82
7.
SUMMARY
.
83
8.
LITERATURVERZEICHNIS
.
84
9.
ANHANG
.
99
9.1.
KULTURMEDIEN
.
99
9.2.
PLASMIDPRAEPARATION
MITTELS
ALKALISCHER
LYSE
.
102
9.3.
DNA-SYNTHESE
UND
AUFREINIGUNG
DER
PRIMER
.
102
9.4.
POLYMERASEKETTENREAKTION
.
102
9.5.
HERSTELLUNG
VON
POLYNUKLEOTIDSONDEN
.
103
9.6.
DNS-DNS-HYBRIDISIERUNG
.
103
9.7.
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
.
104 |
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