Charakterisierung von Kaliumkanalproteinen in Arabidopsis thaliana:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1998
|
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | 137 S. Ill., graph. Darst. |
Internformat
MARC
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INHALT
1
EINLEITUNG
1
1.1
TIERISCHE
SPANNUNGSABHAENGIGE
KALIUMKANAELE
3
1.2
PFLANZLICHE
KALIUMKANAELE
13
1.3
ZIELSETZUNG
16
2
MATERIAL
UND
METHODEN
17
2.1
MATERIAL
17
2.1.1
PFLANZENMATERIAL
17
2.1.2
HEFE
17
2.1.3
BAKTERIEN
17
2.1.4
CDNA-BANKEN
17
2.1.5
VEKTOREN
18
2.1.6
ENZYME
18
2.1.7
CHEMIKALIEN
19
2.1.8
OLIGONUKLEOTIDE
20
2.1.9
FILTER
UND
MEMBRANEN
20
2.1.10
FILMMATERIAL
21
2.1.11
GERAETE
21
2.1.12
DATENVERARBEITUNG
21
2.1.13
KULTURMEDIEN
22
2.1.13.1
BAKTERIEN-UND
PHAGENMEDIEN
22
2.1.13.2
HEFEMEDIEN
22
2.1.13.3
PFLANZENMEDIEN
23
2.1.14
ANTIBIOTIKA,
HORMONE,
STAMMLOESUNGEN
24
2.2
METHODEN
24
2.2.1
DNA
PRAEPARATIONEN
24
2.2.1.1
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
ESCHERICHIA
COLI
24
2.2.1.2
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
AGROBACTERIUM
TUMEFACIENS
25
2.2.1.3
ISOLIERUNG
VON
GENOMISCHER
PFLANZEN-DNA
25
2.2.1.4
SCHNELLPRAEPARATION
VON
GENOMISCHER
PFLANZEN-DNA
25
2.2.2
RNA
PRAEPARATIONEN
25
2.2.2.1
RNA-ARBEITEN
25
2.2.2.2
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
26
2.2.2.3
ISOLIERUNG
VON
POLY(A)
+
-RNA
26
2.2.3
PROTEINPRAEPARATIONEN
26
INHALT
2.2.3.1
PRAEPARATION
VON
PROTEINEN
AUS
ARABIDOPSIS
THALIANA
PFLANZEN
26
2.2.3.2
PRAEPARATION
VON
PROTEINEN
AUS
HEFEN
27
2.2.4
METHODEN
ZUR
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
27
2.2.4.1
BESTIMMUNG
DER
DNA-,
RNA
UND
OLIGONUKLEOTID-KONZENTRATION
27
2.2.4.2
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
(BRADFORD,
1976)
27
2.2.5
ENZYMATISCHE
REAKTIONEN
28
2.2.5.1
SPALTUNG
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENZYMEN
28
2.2.5.2
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA
28
2.2.5.3
AUFFIILLREAKTIONEN
28
2.2.5.4
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
29
2.2.5.5
DNA-SEQUENZIERUNG
29
2.2.5.6
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR;
SAIKI
ET
AL.
(1988))
30
2.2.5.6.1
/ITTSO/D^-SPEZIFISCHE
PCR
AUF
CDNA-BANKEN
30
2.2.5.6.2
.47757
7&S-SPEZIFISCHE
PCR
AUF
CDNA-BANKEN
30
2.2.5.6.3
PCR-AMPLIFIKATION
DES
OFFENEN
LESERASTERS
VON
ATK
V
SSL
30
2.2.5.6.4
PCR
ZUR
KONTROLLE
DER
HEFETRANSFORMATIONEN
31
2.2.5.6.5
PCR
ZUR
ISOLIERUNG
DES
5
'-BEREICHES
VON
RK
V
SSL
32
2.2.5.6.6
INVERSE
PCR
ZUR
HERSTELLUNG
DER
CHIMAERE
PSK.-R-ATK
V
SSL
32
2.2.5.6.7
PCR
ZUR
IDENTIFIZIERUNG
EINER
EN-INSERTION
IN
ATK
V
SSL
UND
TKA1
33
2.2.5.OE.8
PCR
FUER
DIE
UEBERPRUEFUNG
DER
TTANSGENEN
ATK
V
SSL
-PFLANZEN
33
2.2.5.6.9
AMPLIFIKATION
DES
AE2472-PROMOTORS
34
2.2.5.6.10
7AEL4/-SPEZIFISCHE
PCR
AUF
CDNA-BANKEN
34
2.2.5.6.1
1
AMPLIFIKATION
DES
5'-ENDES
VON
TKA1
35
2.2.5.6.12
AMPLIFIKATION
DES
3'-ENDES
VON
TKA1
35
2.2.5.7
5
'-RACE
35
2.2.5.8
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
(IVT)
36
2.2.5.9
MARKIERUNG
VON
DNA
UND
RNA
36
2.2.5.9.1
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA
36
2.2.5.9.2
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
RNA
37
2.2.5.9.3
DIGOXYGENIN
MARKIERUNG
VON
RNA
37
2.2.6
GELELEKTROPHORETISCHE
METHODEN
37
2.2.6.1
AUFTRENNUNG
VON
DNA
UND
ISOLIERUNG
VON
FRAGMENTEN
37
2.2.6.2
AUFTRENNUNG
VON
RNA
37
2.2.6.3
AUFTRENNUNG
VON
PROTEINEN
UND
COOMASSIE
FAERBUNG
38
2.2.7
TRANSFER
VON
PHAGEN,
NUKLEINSAEUREN
UND
PROTEINEN
AUF
MEMBRANEN
38
2.2.7.1
SOUTHERN-BLOT
38
2.2.7.2
IDENTIFIZIERUNG
VON
.4TE
V
/3/-SPEZIFISCHEN
YAC-KLONEN
39
2.2.7.3
NORTHERN-BLOT
39
INHALT
2.2.7.4
TRANSFER
VON
PHAGEN
AUF
NYLONMEMBRANEN
(SCREENING
EINER
CDNA-BANK)
39
2.2.7.5
WESTERN-BLOT
39
2.2.8
NACHWEIS
FILTERGEBUNDENER
SIGNALE
40
2.2.8.1
DNA
HYBRIDISIERUNG
40
2.2.8.2
NORTHERN-BLOT
HYBRIDISIERUNG
40
2.2.8.3
IMMUNFAERBUNG
FILTERGEBUNDENER
PROTEINE
40
2.2.9
TRANSFORMATIONS
UND
TRANSFEKTIONSMETHODEN
41
2.2.9.1
BAKTERIEN
41
2.2.9.1.1
PRAEPARATION
ELEKTROKOMPETENTER
ESCHERICHIA
CO/I-ZELLEN
41
2.2.9.1.2
PRAEPARATION
ELEKTROKOMPETENTER
AGROBACTERIUM
TUMEFACIENS
ZELLEN
41
2.2.9.1.3
BAKTERIENTRANSFORMATION
41
2.2.9.1.4
ISOLIERUNG
VON
PSK-CDNA-KLONEN
AUS
LAMBDA
ZAP
II-PHAGEN
(IN
VIVO
EXCISION)
41
2.2.9.2
HEFE
42
2.2.9.2.
1
PRAEPARATION
KOMPETENTER
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
ZELLEN
42
2.2.9.2.2
HEFETRANSFORMATION
42
2.2.9.3
PFLANZEN
42
2.2.9.3
.1
ANZUCHT
VON
ARABIDOPSIS
THALIANA
FILR
DIE
TRANSFORMATION
42
2.2.9.3.2
PFLANZENTRANSFORMATION
42
2.2.10
KULTIVIERUNG
VON
ARABIDOPSIS
THALIANA
PFLANZEN
42
2.2.10.1
OBERFLAECHENSTERILISATION
VON
SAMEN
42
2.2.10.2
KULTURBEDINGUNGEN
43
2.2.10.3
ARABIDOPSIS
THALIANA
WURZELKULTUREN
43
2.2.10.4
SEGREGATIONSANALYSEN
43
2.2.11
QUALITATIVE
GUS-ANALYSEN
43
2.2.12
HERSTELLUNG
VON
ANTIKOERPERN
43
2.2.12.1
EXPRESSION
VON
HIS-TAG-FUSIONSPROTEINEN
IN
ESCHERICHIA
COLI
43
2.2.12.2
IMMUNISIERUNG
VON
KANINCHEN
MIT
HIS-ATK
V
SSL
UND
HIS-ATK
V
SS2
44
2.2.12.3
AFFINITAETSREINIGUNG
DES
POLYKLONALEN
ANTI-ATK
V
SSL-ANTISERUMS
44
2.2.13
SPEZIFISCHE
DETEKTION
VON
PROTEINEN
UND
RNA
IN
ARABIDOPSIS
THALIANA
GEWEBESCHNITTEN
44
2.2.13.1
PARAFFINSCHNITTE
44
2.2.13.2
IMMUNZYTOCHEMIE
45
2.2.13.3
IN
SITU
HYBRIDISIERUNG
45
2.2.14
PLASMIDE
46
2.2.14.1
HERSTELLUNG
VON
PRS3
1
6-ADH-ATK
V
SSL
UND
PRS3
1
6-CUP-ATKYYSS2
46
2.2.14.2
HERSTELLUNG
VON
PGEMHE-ARKJW,
-KAT1,
R-ATKYYSSL
UND
-TKA1
46
INHALT
2.2.14.4
HERSTELLUNG
VON
PBLUESCRIPT
SK-7X47
47
2.2.14.3
HERSTELLUNG
DER
CHIMAERE
R-ATK
V
SSL
47
3
ERGEBNISSE
50
3.1
ISOLIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
MOEGLICHER
SS-UNTEREINHEITEN
SPANNUNGSABHAENGIGER
KALIUMKANAELE
AUS
ARABIDOPSIS
THALIANA
SO
3.1.1
IDENTIFIZIERUNG
DER
EST-KLONE
ATTS0764
UND
ATTS1788
50
3.1.2
ISOLIERUNG
DER
VOLLSTAENDIGEN
CDNA-KLONE
50
3.1.2.1
ISOLIERUNG
DER
ATKVSSL
CDNA
51
3.1.2.2
ISOLIERUNG
DER
ATK
V
SS2
CDUA.
51
3.1.2.3
ANALYSE
DER
ATKVSSL
UND
ATK
V
SS2
PROTEINSEQUENZEN
52
3.1.3
SOUTHEM-BLOT
ANALYSEN
56
3.1.3.1
ATKYYSSL
SOUTHEM-BLOT
ANALYSEN
56
3.1.3.2
ATK
V
SS2
SOUTHEM-BLOT
ANALYSEN
57
3.1.4
NORTHEM-BLOT
ANALYSEN
59
3.1.4.1
ATK
V
SSL
NORTHEM-BLOT
ANALYSEN
60
3.1.4.2
ATK
V
SS2
NORTHEM-BLOT
ANALYSEN
61
3.1.5
WESTEM-BLOT
ANALYSEN
62
3.1.5.1
POLYKLONALE
ATK
V
SSL
UND
ATK
V
SS2-ANTISEREN
62
3.1.5.2
CHARAKTERISIERUNG
DER
ATK
V
SSL
UND
ATK
V
SS2-ANTISEREN
64
3.1.5.3
AFFINITAETSREINIGUNG
VON
ANTI-ATK
V
SS
1
67
3.1.6
ZELLULAERE
LOKALISATION
VON
ATK,SSL
71
3.1.6.1
IMMUNZYTOCHEMIE
71
3.1.6.2
7
SITU
HYBRIDISIERUNG
75
3.1.7
HETEROLOGE
EXPRESSION
VON
ATK
V
SSL
MIT
KALIUMKANAL
A-UNTEREINHEITEN
IN
XENOPUS
LAEVIS
OOZYTEN
77
3.1.8
HOMOLOGE
EXPRESSION
VON
ATK
V
SSL
IN
ARABIDOPSIS
THALIANA
79
3.1.8.1
HERSTELLUNG
VON
SENSE/ANTWEWE-VEKTORKONSTRUKTEN
79
3.1.8.2
TRANSFORMATION
IN
ARABIDOPSIS
THALIANA
80
3.1.8.3
WESTEM-BLOT
ANALYSEN
81
3.1.8.3.1
WACHSTUMSPEZIFISCHE
EXPRESSION
VON
ATK
V
SSL
81
3.1.8.3.2
WESTEM-BLOT
ANALYSEN
DER
ATK
V
SSL-SENSE
UND
ATK
V
SSL-ANTISENSE-PFLANZEN
82
3.1.8.4
NORTHEM-BLOT
ANALYSEN
83
3.1.8.5
SOUTHEM-BLOT
ANALYSEN
85
3.1.8.6
CHARAKTERISIERUNG
DES
PHAENOTYPS
88
3.1.9
UNTERSUCHUNG
EINER
EN-MUTANTENBANK
92
3.1.10
GENOMISCHE
KARTIERUNG
VON
ATK
V
SSL
92
INHALT
3.2
CHARAKTERISIERUNG
VON
KALIUMKANAL-A-UNTEREINHEITEN
AUS
ARABIDOPSIS
THALIANA
94
3.2.1
LOKALISATION
DER
KAT2
EXPRESSION
DURCH
GUS-STUDIEN
95
3.2.1.1
HERSTELLUNG
DES
P.K4T2-GT7S-VEKTORKONSTRUKTES
95
3.2.1.2
TRANSFORMATION
IN
ARABIDOPSIS
THALIANA
97
3.2.1.3
QUALITATIVE
GUS-ANALYSEN
97
3.2.1.4
SOUTHEM-BLOT
ANALYSEN
101
3.2.2
ISOLIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
EINER
NEUEN
KALIUMKANAL-A-UNTEREINHEIT
103
3.2.2.1
ISOLIERUNG
DER
CDNA
103
3.2.2.2
TKA1
SEQUENZANALYSEN
104
3.2.2.3
MOLEKULARGENETISCHE
CHARAKTERISIERUNG
VON
TKA1
106
3.2.2.4
CHARAKTERISIERUNG
EINER
EN-INSERTIONSMUTANTE
108
3.2.2.4.1
SEGREGATIONSANALYSEN
110
4
DISKUSSION
111
4.1
ISOLIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
SS-UNTEREINHEITEN
AUS
ARABIDOPSIS
THALIANA
111
4.2
NACHWEIS
VON
ATK
V
SSL
UND
ATK
V
SS2
IN
ARABIDOPSIS
THALIANA
114
43
ZELLULAERE
LOKALISATION
VON
ATK
V
SSL
116
4.4
FUNKTIONSANALYSEN
VON
ATK
V
SSL
117
4.5
PROMOTOR-GUS-ANALYSEN
ZUR
LOKALISATION
DER
KAT2
EXPRESSION
123
4.6
ISOLIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
TKA1
124
4.7
PERSPEKTIVEN
127
5
ZUSAMMENFASSUNG
128
LITERATUR
ANHANG |
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| author | Spoormaker, Petra 1968- |
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